DTL的亚细胞定位研究

2023-07-19唐钰梅任来峰黄翔李强程乐

医学研究与教育 2023年3期

唐钰梅，任来峰，黄翔，李强，程乐

(1.大理大学基础医学院，云南大理 671000；2.山西省肿瘤医院免疫室，山西太原 030003；3. 山西省妇女儿童保健院生殖医学中心，山西太原 030000)

0 引言

无齿蛋白同源物(denticleless protein homolog，DTL)又名维甲酸调节的核基质相关蛋白(retinoic acid regulated nuclear matrix associated protein，RAMP)，是一种DCX (DDB1-CUL4-X-box)E3 泛素-连接酶复合物的底物识别受体，参与识别多种DNA复制和细胞周期相关蛋白，如CDT1、p21等，并介导他们的多泛素化降解，维持基因组稳定性[1-2]。DTL已被发现在某些癌症如宫颈癌、胃癌等中表达显著增高，促进肿瘤细胞快速增殖，与癌症的发生发展密切相关[3-4]。在T47D细胞、HBC4细胞中敲除DTL基因会导致细胞分裂失败，使细胞停滞于G2/M期，进而诱导细胞死亡[5-6]。DTL是维甲酸诱导的NT2细胞神经分化过程中差异调控的下调基因，主要位于细胞核[5]。在DNA双链断裂发生时DTL从细胞核转移到染色质损伤位点，调控损伤修复[7]。

亚细胞定位是研究生物大分子的重要技术手段，用来判定生物大分子发挥生物学功能的场所以及是否能够发挥正确的功能。特定的蛋白质只有在特定位置上与特定的蛋白质发生相互作用，才能发挥正确的生物学功能，一旦某些蛋白的亚细胞定位发生改变，不仅影响其功能，甚至会影响细胞的增殖、分化及死亡，因此对蛋白质亚细胞定位的研究具有重要意义[8]。

细胞增殖是指细胞在细胞周期蛋白、细胞周期蛋白激酶及表观遗传调控等其他机制充分的驱动下进行分裂、增殖和分化[9-10]。哺乳动物的细胞增殖主要包括有丝分裂和减数分裂两种，受到细胞周期蛋白依赖性激酶及其调节细胞周期蛋白的严格调控。细胞周期调控是疾病和再生的关键因素，关键调控因子的异常表达与癌症患者的不良预后和较短的生存期相关。肿瘤也是一种分化异常的疾病，在肿瘤细胞中恶性程度高，意味着该肿瘤细胞分化程度低，增殖速度快，与正常细胞的形态、代谢、功能的差别显著，容易发生侵袭、复发和转移。此外，在男性生殖细胞中不同细胞也具有不同的增殖速率，其细胞增殖速率及细胞分化程度由低到高依次为精子、次级精母细胞、初级精母细胞、精原细胞。

综上，DTL在细胞增殖和分化调控中起着重要作用，因此，本研究通过在多种组织、细胞中，进行免疫荧光(immunofluorescence，IF)和免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)检测DTL的亚细胞定位，并通过分步提取细胞成分和蛋白质印迹(Western blotting，WB)进行实验验证，探讨DTL亚细胞定位改变对细胞增殖和分化的潜在调控作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞

人胚肾HEK293T细胞株购自中国武汉BOSTER公司。人输尿管上皮永生化细胞SV-HUC-1细胞株、人胃癌MKN28/MGC803细胞株、人结直肠癌HCT116/HT29细胞株购自湖南丰晖生物公司。小鼠精原细胞GC-1 spg、小鼠精母细胞GC-2 spd细胞株购自中国科学院昆明动物研究所。人膀胱癌移行细胞T24细胞株购自吉凯基因(上海)。

1.1.2 抗体和试剂

本研究主要使用以下抗体：兔抗DTL单抗(Abcam，ab72264，IHC/IF 1∶100稀释，WB 1∶500稀释)、兔抗R-CY3二抗(Sigma，A05455，IHC/IF 1∶2000稀释)、鼠抗α-Tubulin单抗(Sigma，T6074，WB 1∶50000稀释)、兔抗H3单抗(武汉三鹰，17168-I-qp，WB 1∶500稀释)，HRP标记的抗兔、鼠二抗 (Sigma，A05455，A4416，WB 1∶2000稀释)。

本研究主要使用以下试剂：4%多聚甲醛购自默克公司，抗荧光淬灭封片剂DAPI购自Vector Laboratories，免疫组织化学试剂盒(二抗、非特异性阻断剂H2O2、DAB显色剂)购自基因科技有限公司，细胞培养基、SDS样品缓冲液购自BOSTER公司，胎牛血清、PVDF膜购自Sigma公司，双抗购自Invitrogen公司。

1.1.3 临床标本来源

收集2012—2022年山西省肿瘤医院病理科存档的非肿瘤患者肝穿及肝细胞癌病理活检石蜡标本各10例，结直肠癌及癌旁病理活检石蜡标本各10例，肺癌及非肿瘤病理活检石蜡标本各10例，膀胱癌及癌旁病理活检石蜡标本各10例，胃癌及癌旁病理活检石蜡标本各10例，所有患者均在山西省肿瘤医院行手术治疗，且术前均未行放疗、化疗。收集山西省儿童医院、山西省妇幼保健院患者睾丸组织病理切片5例，本研究获得山西省肿瘤医院伦理委员会、山西省儿童医院、山西省妇幼保健院伦理委员会批准(202225，202053)，参与者提供了参与本研究的书面知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

所有细胞均培养在37 ℃条件下含5% CO2的培养箱中，HT29细胞在McCoy’s 5A培养基中培养，SV-HUC-1细胞、T24细胞在1640培养基中进行培养，其余细胞均在DMEM培养基中培养，所有培养基含有10%胎牛血清和1%双抗。取生长状态良好的细胞进行铺板，将细胞铺在含盖玻片的24孔板中，待生长至60%～70%时收样。

1.2.2 IF染色

对于细胞IF染色，将爬片用PBS清洗1次，4%多聚甲醛固定10 min，然后用含0.3% Triton X-100的PBS通透10 min，封闭液封闭40 min，一抗孵育30 min(37 ℃)，后与荧光二抗孵育30 min(37 ℃)。在固定、通透、抗原修复和抗体孵育后，均用PBS充分清洗3次，每次5 min。最后，使用DAPI染细胞核，并将爬片安装在载玻片上。

对于组织石蜡标本，在65 ℃烤箱中烤片40 min后，置于二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，再用0.3%Triton X-100通透10 min，于柠檬酸盐缓冲液 (pH 6.0)中高压加热抗原修复2 min，然后用3%过氧化氢浸泡10 min去除内源性过氧化酶，封闭液封闭30 min后加入一抗，4 ℃孵育过夜，最后加入免疫组化试剂盒里的二抗，37 ℃孵育30 min，使用DAPI染细胞核并快速封片，在通透、抗原修复和抗体孵育后，均用PBS充分清洗3次，每次5 min。

1.2.3 细胞核质分离和WB

对于全细胞提取，细胞在1×SDS样品缓冲液裂解，获得T24和HT29细胞的全细胞裂解液。使用Méndez和Stillman的方法分步提取细胞[11]，获得T24和HT29细胞的分步提取液，细胞质提取液为S1，游离染色质为S2，结合染色质为P3，随后加入SDS裂解液，并在100 ℃下煮沸7 min使其变性。然后，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，并转移到PVDF膜上。为了检测DTL蛋白的表达，以细胞质蛋白α-Tubulin、细胞核蛋白H3作为内参。将PVDF膜用溶于TBST缓冲液的5%脱脂牛奶封闭，并在4 ℃下与在封闭缓冲液中稀释的一抗孵育过夜，然后用TBST缓冲液洗涤3次。随后，将膜与HRP标记的二抗在室温下孵育1 h，洗涤后加入发光液，并通过成像系统进行曝光。

1.2.4 IHC染色

对于组织石蜡标本的IHC染色，DAB显色之前所有步骤同IF染色，之后用 PBS洗去二抗，加入DAB显色液显色4～5 min，当组织呈现褐色时立即用自来水清洗，放入苏木素染色液中染色1 min，自来水清洗后沥干水分，放入分化液中分化20 s，自来水冲洗后反蓝，最后进行脱水、透明，中性树脂快速封片。

1.2.5 实验结果观察和分析

使用奥林巴斯荧光显微镜(BX51)观察，CellSens Entry软件保存图像，Ipwin32软件分析实验结果。

2 结果

2.1 DTL在细胞分裂期与分裂间期的亚细胞定位

为了探讨DTL在细胞中的表达定位，使用IF对T24细胞进行DTL染色(红)和细胞核DAPI染色(蓝)，并使用Ipwin32软件将两者染色合并(Merge)，用圆圈圈出有丝分裂期的细胞。在T24细胞有丝分裂间期DTL染色与细胞核染色IF共定位，即DTL主要表达于细胞核，而在T24细胞有丝分裂的前、中、后期，DTL的表达位于染色质周围(图1A)。为进一步证实这一点，在两种正常细胞293T、SV-HUC-1和一种胃癌细胞MKN28进行同样的DTL染色与细胞核染色，同样发现在有丝分裂时，DTL的表达位于染色质周围(图1B)。

A T24细胞；B 293T、SV-HUC-1、MKN28细胞图1 DTL在培养细胞的有丝分裂期的亚细胞定位(40×)

2.2 DTL在不同细胞有丝分裂间期的亚细胞定位

探索DTL在细胞中的表达定位时，发现在正常细胞和癌细胞的有丝分裂间期DTL染色结果也存在明显差异。在有丝分裂间期的正常细胞293T、SV-HUC-1细胞，DTL的表达主要位于细胞核，而在胃癌MKN28细胞、MGC803细胞、膀胱癌T24细胞，核质均表达，且在胃癌MGC803细胞质表达更高，而在结直肠癌HT29的有丝分裂间期，DTL仅在细胞质表达(图2A)。此外，在T24细胞与HT29细胞进行了细胞核、细胞质分离，采用WB检测DTL的表达，同样证实DTL在T24细胞的细胞核与细胞质中均表达，而在HT29细胞中仅在细胞质表达(图2B)。为进一步探究DTL在其他类型细胞有丝分裂间期的亚细胞定位，在小鼠精原细胞和精母细胞中同样进行了DTL与细胞核染色，分析DTL亚细胞定位的表达差异，DTL在小鼠精母细胞表达主要位于细胞核，而DTL的表达在小鼠精原细胞表达主要位于细胞质(图2C)。

A 不同细胞的IF图片(40×)；B WB检测DTL的表达；C 小鼠生殖细胞的IF图片(40×)图2 DTL在培养细胞的有丝分裂间期的亚细胞定位

2.3 DTL在不同组织的亚细胞定位改变

进一步分析不同组织中的DTL表达。通过IF染色，发现在结直肠、肺、膀胱的正常组织中，DTL的表达主要位于细胞核，结直肠、肺、膀胱的癌组织中，DTL的表达主要位于细胞质(图3A)。为了排除实验方法的干扰，通过IHC在肝、胃的癌组织和正常组织中进行了DTL染色，进一步证实DTL表达在正常组织中主要位于细胞核，在癌组织中主要表达于细胞质，且DTL在癌组织表达量明显高于正常组织(图3B)。最后，在睾丸组织中进行IF染色，在精原细胞中，DTL主要在细胞质中表达，且越靠近组织中央，细胞越趋于精子细胞，DTL在细胞核中表达越明显，在精子细胞时完全核表达，并且表达量明显增多(图3C)。

A 癌和非癌组织的IF图片；B 癌和非癌组织的IHC图片；C 人睾丸组织的IF图片图3 不同组织中DTL的亚细胞定位(20×)

3 讨论

DTL在 DNA 复制、DNA损伤修复、细胞周期、细胞增殖中起重要作用。研究显示，DTL在癌组织中的表达往往高于正常组织[3-5]。本研究中，通过IF与IHC在结直肠、肝、胃和膀胱组织同样证实了相比正常组织，DTL在肿瘤组织中表达明显升高。DTL表达与癌症中的细胞周期和DNA复制相关途径有关，是细胞从G1期向S期转变的调节因子，通过识别多种细胞周期相关蛋白来维持细胞周期的顺利进行，抑制DTL的表达也会抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭[1-5]。

特定的蛋白质只有在特定位置才能发挥正确的生物学功能[9]，如细胞周期蛋白依赖性激酶5的定位在细胞核中，在NIH3T3细胞周期中亚细胞定位从以核为主转变为胞质为主，阻止细胞周期蛋白依赖性激酶5迁移出细胞核会导致细胞周期抑制[12]。Merlin蛋白是一种经典的肿瘤抑制蛋白，Merlin与细胞迁移和黏附有关，这一功能反映在它在质膜和已知相互作用伙伴的亚细胞定位上[13]。DTL作为核基质相关蛋白，其亚细胞定位主要位于细胞核中，在细胞分裂期，DTL定位到染色质周围[6-7]。本实验采用IF染色在不同细胞中观察DTL的亚细胞定位，首次发现DTL在不同细胞和组织中的亚细胞定位会发生改变，在正常细胞和精子细胞中，DTL表达主要位于细胞核，而在某些分化程度低的细胞如肿瘤细胞、精原细胞中，DTL则主要位于细胞质。这些结果表明，DTL的质核转位可能与细胞分化程度相关。此外，根据肿瘤细胞与正常细胞、精原细胞与精子细胞的特性，肿瘤细胞增殖速度明显比正常细胞快，而精原细胞同样在进行减数分裂从而产生精子细胞，精子细胞不进行分裂。以上提示DTL的亚细胞定位变化可能参与细胞分化和增殖调控。

肿瘤细胞、精原细胞与正常细胞、精子细胞之间增殖速度具有明显差异是否与DTL亚细胞定位的转变具有相关性需要进一步实验论证。通过在UniProt数据库检索DTL蛋白，分析DTL的序列发现第197—203基因序列是DTL的核定位信号，因此，阻断DTL的核转移信号是否影响细胞增殖，影响DTL的生物学功能，进而影响胚胎的发育、精子的发生以及肿瘤的发生、增殖、浸润，有待进一步实验验证其确切的生物学意义和具体的机制。