探究士的宁对小鼠皮层神经元兴奋性的影响

赵晓燕，张勇刚，沈瑞芳，刘淑娇

1.朔州职业技术学院医护系，山西朔州 036002；2.朔州职业技术学院生物工程系，山西朔州 036002；3.哈尔滨工业大学空间环境与物质科学研究院，黑龙江哈尔滨 150001

士的宁（strychnine）又名番木鳖碱，是马钱子中主要的药理成分[1]，能抗肿瘤、抗炎症、促进血液循环，还具有抗疼痛、保护神经等多种作用，故具有十分重要的药用价值[2-3]。研究已经发现，士的宁对脊髓、延髓与大脑皮层等神经中枢均有兴奋性作用[4]，通过调节生物体Na+电流、K+电流、Ca2+电流等各种电流[5]，或者神经递质乙酰胆碱[6]和甘氨酸[7]等来影响神经元的兴奋性。神经元的兴奋性又能够影响整个神经系统的兴奋或抑制。已有研究证明，一些神经系统类的疾病，如精神病、癫痫、老年痴呆、孤独症谱系障碍等疾病的发生均与神经系统的过度兴奋和过度抑制有关[8]。在保持神经元静息电位不变的前提下，研究士的宁对动作电位（action potential, AP）阈值的影响，可以检测士的宁对神经元兴奋性的作用。通过研究单个AP 和单位时间内AP 发放个数，可以进一步探究具体是作用于何种离子而引起兴奋性，探讨是否对神经元有保护作用，所以探究士的宁对神经元兴奋性的影响具有十分重要的意义。本文选取2019 年6—10 月大连理工大学提供的小鼠皮层神经元细胞30 个，采用膜片钳技术，以皮层神经元细胞为材料，探究士的宁对皮层神经元AP 和电压依赖性K+电流的影响，初步研究士的宁对神经兴奋性的影响和作用机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究材料

KM 小鼠皮层神经元细胞由大连理工大学生命科学院实验中心提供。

1.2 方法

1.2.1 全细胞膜片钳记录 采用5 步拉制法拉制出玻璃微电极，灌注电极内液，电极电阻为7～9 MΩ。弃掉培养皿中的旧培养基，加入2 mL 电极外液。通过倒置显微镜，找胞体呈锥体形或三角形、表面干净、有较强反光的神经细胞进行实验。借助三维操纵仪把正压的玻璃微电极靠近皮层神经元，把正压撤去，向下移动玻璃微电极，使其与皮层神经元细胞膜刚刚接触，通过给予玻璃微电极适当负压，使其与细胞膜紧密吸附形成高阻封接，接着通过施加快速负压打破神经元细胞膜，形成全细胞膜片钳记录模式。

1.2.2 分组与处理 随机选取6 个小鼠皮层神经元细胞形成全细胞膜片钳记录。针对每一个皮层神经元细胞，在加药前用膜片钳记录的数据为对照组，通过MPS-1 加药系统分别加入0.001、0.01、0.1、1、10 μmol/L 士的宁所得数据作为A、B、C、D、E 共5 个实验组。发现1、10 μmol/L 士的宁能显著地抑制动作电位阈值，即可以影响皮层神经元兴奋性，而0.001、0.01、0.1 μmol/L 士的宁没有影响，所以后续不需要再进行研究。士的宁的中毒剂量是5～10 mg[9]，本研究所选的5 个浓度均在安全范围，1、10 μmol/L士的宁均有作用，但士的宁的安全剂量范围比较小[10]，故后续实验仅选取小剂量D组即1 μmol/L进行研究。

1.3 观察指标

1.3.1 AP 阈值 采用电流钳技术，具体Protocol：将膜电流钳制在200 pA，给予时程为10 ms 的阈上刺激，记录加药前AP 阈值。

1.3.2 AP 上升支和下降支时程 采用电流钳技术，具体Protocol：膜电流钳制在160 pA，给予时程为10 ms 的阈上刺激，诱发AP，记录加药前后AP 上升支和下降支时程。

1.3.3 单个AP 峰值 采用电流钳技术，具体Protocol：膜电流钳制在100 pA，给予时程为500 ms 的阈上刺激，记录加药前后单个AP 峰值。

1.3.4 AP 重复发放频率 采用电流钳技术，具体Protocol：设置（500 ms，100 pA）的电流钳制刺激，记录加药前后AP 发放个数。

1.3.5 电压依赖性K+电流 采用电压钳技术，具体Protocol：将膜电压钳制在-10 mV，先给予一个时程为300 ms，复极化至-100 mV 的刺激，再恢复至-10 mV 后去极化至+40 mV，每10 mV 阶跃1 次，时程150 ms。为了排除细胞间的差异，用电流密度（pA/pF）代替电流，计算公式：pA/pF=Imax/Cs（Imax是电流峰值，Cs 为膜电容）。

1.4 统计方法

使用Pulse 和Clamfit 软件设置记录参数（protocal）、统计和整理数据，再使用Origin 软件绘制统计图。符合正态分布的计量资料以（±s）表示，采用t检验分析实验数据，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同士的宁浓度间神经元细胞的AP 阈值比较

A、B、C 组神经元AP 阈值低于对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。D、E 组神经元AP 阈值低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 不同士的宁浓度间神经元细胞的AP 阈值比较[(±s),mV]

表1 不同士的宁浓度间神经元细胞的AP 阈值比较[(±s),mV]

注：t 值、P 值为各组与对照组比较所得检验值

组别对照组（n=6）A 组（n=6）B 组（n=6）C 组（n=6）D 组（n=6）E 组（n=6）士的宁浓度（μmol/L）0 0.001 0.01 0.1 1 10 AP 阈值-41.43±1.31-41.51±1.50-41.57±1.59-42.63±1.80-44.30±1.99-46.54±2.41 t 值0.098 0.166 1.320 2.951 4.563 P 值＞0.05＞0.05 0.110 0.008＜0.001

2.2 D 组与对照组神经元细胞的AP 时程宽度比较

D 组AP 上升支时程高于对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05），D 组AP 下降支时程高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 D 组与对照组神经元细胞的AP 时程宽度比较[(±s),ms]

表2 D 组与对照组神经元细胞的AP 时程宽度比较[(±s),ms]

组别对照组（n=6）D 组（n=6）t 值P 值AP 上升支时程2.83±0.21 2.91±0.23 0.629 0.250 AP 下降支时程4.56±0.38 6.02±0.71 4.441＜0.001

2.3 D 组与对照组神经元细胞的单个AP 峰值比较

D 组单个AP 峰值低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 D 组与对照组神经元细胞的单个AP 峰值比较[(±s),mV]

表3 D 组与对照组神经元细胞的单个AP 峰值比较[(±s),mV]

组别对照组（n=6）D 组（n=6）t 值P 值单个AP 峰值30.23±3.76 22.12±2.13 4.597＜0.001

2.4 D 组与对照组神经元细胞的AP 个数比较

D 组AP 个数少于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 D 组与对照组神经元细胞的AP 个数比较[(±s),个]

表4 D 组与对照组神经元细胞的AP 个数比较[(±s),个]

组别对照组（n=6）D 组（n=6）t 值P 值AP 个数6.84±1.73 4.52±1.21 2.692 0.012

2.5 D 组与对照组神经元细胞的电流密度比较

在膜电位≥-10 mV 时，D 组电流密度呈电压依赖性地低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表5。

表5 D 组与对照组神经元细胞的电流密度比较[(±s),PA/PF]

表5 D 组与对照组神经元细胞的电流密度比较[(±s),PA/PF]

膜电位（mV）-10 0 10 20 30 40对照组（n=6）176.72±16.76 255.14±20.37 369.69±21.30 487.41±23.25 627.79±32.47 759.52±44.62 D 组（n=6）130.13±26.95 186.10±25.45 256.60±24.57 325.16±26.63 390.81±30.59 448.02±36.45 t 值3.596 5.188 8.519 11.242 13.012 13.243 P 值0.002＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

3 讨论

士的宁作为中枢兴奋类药物，当前对其研究主要集中在神经保护机制方面。一些作用于中枢系统类的药物可以通过调节神经递质释放过程或者离子活动来传导兴奋性或抑制性信号[11-12]。膜片钳电生理技术已经成熟，故药理机制的研究越来越多从离子通道着手，所以本文利用全细胞膜片钳技术，以新生KM 小鼠皮层神经元为材料，通过研究AP 和电压依赖性K+电流，来探讨士的宁对皮层神经元的中枢兴奋性机制。首先采用电流钳技术研究士的宁对单个AP 的阈电位的作用，发现士的宁能降低阈电位，说明士的宁能兴奋皮层神经元。Tan T 等[13]研究表明：降低AP 阈值能提高神经元兴奋性与本研究一致，又因为AP 上升支主要是因为电压依赖性钠电流引起[14]，而AP 下降支主要是由电压依赖性K+电流引起[15]，所以又研究了士的宁对单个AP 时程宽度的影响，发现士的宁能主要影响AP 下降支时程，对上升支时程没有影响，所以士的宁降低AP 阈值是因为电压依赖性K+外流引起。

此外，已有研究表明，一些神经保护类药物可以通过抑制皮层神经元电压依赖性K+，能够延长单一动作电位下降支时程，减少单位时间内动作电位重复发放频率，进而发挥神经保护作用[16]。本文研究士的宁对连续AP 的作用，发现其能够降低重复发放频率，这也表明士的宁可以兴奋皮层神经元，对神经元细胞具有保护作用，并初步推测士的宁对皮层神经元的兴奋性主要是通过作用于K+电流来实现的。故本研究又检测了士的宁对电压依赖性K+电流的作用，结果发现在膜电位≥-10 mV 时，士的宁能显著地降低电流密度且呈电压依赖性，这就证明了上述推测是正确的。类似研究中，以豚鼠心肌细胞为材料，同样采用膜片钳技术研究马钱子对电压依赖性K+电流的作用，结果显示3 μmol/L 马钱子使+40 mV 时电流密度由（1.12±0.21）降为（0.95±0.24）（n=6，P＜0.05）[17]，因为马钱子的主要药理成分是士的宁[1]，同样证明士的宁对电压依赖性K+电流有抑制作用，与本研究结果基本一致。本研究在40 mV 时电流密度由（759.52±44.62）PA/PF 降为（448.02±36.45）PA/PF（P＜0.05），可能是因为膜片钳仪器不同、细胞存在差异和具体的刺激Protocol 不一样引起，但是针对每一个细胞，均是通过加药前后进行对比，影响趋势是一致的。

Zlotos DP 等[18]从神经递质的释放过程着手来研究士的宁的中枢兴奋作用，其研究显示小剂量的士的宁能够与抑制性神经递质-甘氨酸竞争受体结合，解除抑制，兴奋中枢神经如大脑皮层感觉中枢，降低感觉神经末梢和交感神经的兴奋阈值，能使昏迷的患者苏醒过来，与本研究结果一致。但是已有研究证明士的宁能够透过血脑屏障[19]，所以本研究着重以皮层神经元细胞为直接作用对象，通过膜片钳技术研究AP，从离子通道的角度解释了小剂量士的宁能够兴奋大脑皮层，使昏迷的患者苏醒[12]。

综上所述，小剂量士的宁一方面能够兴奋大脑皮层，其作用机制是降低AP 阈值，提高皮层神经元兴奋性；另一方面小剂量士的宁能够通过抑制皮层神经元电压依赖性K+电流，减少复极化中K+外流，降低AP 重复发放频率，减少能量消耗，保护皮层神经细胞。