小麦木瓜类半胱氨酸蛋白酶基因TaRD21的克隆 及赤霉病菌诱导下的表达分析

蒋正宁,高致富,寿露露,江 伟,王 玲,陈甜甜,张 勇,高德荣

(江苏里下河地区农业科学研究所/农业部长江中下游小麦生物与遗传改良重点实验室,江苏扬州 225007)

小麦赤霉病主要是由禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)引起的一种严重的小麦穗部病害,除造成产量降低外,在病原菌侵染过程中也会产生多种真菌毒素,严重危害人畜健康。小麦赤霉病抗性是由多基因控制的数量性状[1],抗性机制较为复杂,至今尚未发现高抗赤霉病的品种。因此,挖掘抗赤霉病基因对于培育抗性品种具有重要意义。

木瓜类半胱氨酸蛋白酶(PLCPs)广泛存在于多种植物中,参与种子萌发[2]、花药发育[3]、衰老[4-5]以及逆境胁迫响应[6-9]等多种生理过程,且在植物细胞程序性死亡(PCD)过程中发挥重要调控作用[10-11]。研究表明,PLCPs作为植物抗病反应的关键酶,其缺失或突变会导致植物免疫系统受损,减弱寄主的抗病性[8]。如在烟草中沉默PLCPs家族基因NbCathB,能够抑制ROS的积累和内质网压力诱导的过敏性-程序性细胞死亡(HR-PCD)[11];拟南芥PLCPs家族基因xcp2突变会导致其更易受到茄科青枯劳尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)的侵染[12]。拟南芥PLCPs家族重要成员RD21被认为是细胞死亡的前体信号[13],敲除或者沉默RD21会导致拟南芥更易受到灰霉[14]、卵菌[15]和细菌[16]的侵染;同时拟南芥中RD21还负调控霉菌毒素FB1(伏马菌素B1)诱导的PCD[17]。

本课题组前期通过RNA-seq数据分析,从抗赤霉病小麦品种(扬麦17)和感赤霉病小麦品种(扬麦15)转录组测序中筛选到一个差异表达基因(Traes_2DL_02G546600)。本研究基于该基因序列设计引物,从小麦中克隆获得三个TaRD21基因(TaRD21-2A/2B/2D),然后对这三个基因进行生物信息学分析,并分析水杨酸(SA)、乙烯利(ETH)及赤霉病菌诱导下这三个基因的表达特性,以期为进一步解析RD21基因在小麦中的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试小麦材料的感赤霉病品种扬麦15和抗赤霉病品种扬麦17,均由本实验室保存。所用赤霉病菌为强致病力菌株f0609,由江苏省农科院植保所陈怀谷研究员提供。

1.2 诱导处理及cDNA合成

将扬麦15和扬麦17分别种植于温室花盆中,待出苗后在4 ℃人工气候室中春化3周,然后转移至温室中,每天光照16 h,平均温度28 ℃(昼)/16 ℃ (夜)。将预培养2～3 d的赤霉病菌接种于绿豆汤培养基中,25 ℃振荡培养4～5 d,使其产生孢子。用4层无菌纱布过滤菌丝,收集孢子,然后用无菌水将孢子液浓度调至5×105～10×105个·mL-1。于开花期采用单花滴注接种法进行接种,每小花接种孢子悬浮液10 μL,以无菌水处理为对照,并作标记。接种后用透明塑料袋套袋保湿,在接种0、24、48和72 h后采集颖壳,每个时间点分别取10穗。

待扬麦17和扬麦15生长2周左右,用2 mmol·L-1水杨酸(SA)和200 μmol·L-1乙烯利(ETH)喷施小麦叶片。分别在喷施0、2、4、6、12和24 h后取样,以喷施蒸馏水为对照。

以上所有处理的小麦样品采集后迅速置于液氮中处理,-80℃冰箱保存。用Eastep○RSuper Total RNA Extraction Kit试剂盒(Promega,美国)分别提取上述样品的总RNA,用M-MLV Reverse Transcriptase试剂盒(Promega,美国)合成 cDNA。所有处理均设3次生物学重复。

1.3 TaRD21基因的克隆

前期利用RNA-seq数据分析了抗赤霉病小麦品种扬麦17和感赤霉病小麦品种扬麦15接种赤霉病菌后基因表达谱之间的差异,获得1个注释为RD21 Cysteine proteases的EST(Traes_2DL_02G546600),以此序列检索小麦最新基因组数据库WheatOmics 1.0(http://202.194.139.32),获得基因CDS序列。根据CDS序列设计引物TaRD21-F/R(表1),以接菌72 h后的扬麦17颖壳cDNA为模板进行扩增。PCR扩增体系为20 μL,包括2×Phanta Max Master Mix 10 μL(诺唯赞,南京),模板cDNA 2 μL,上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL,ddH2O 7.0 μL。PCR扩增程序:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,68 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,35个循环;72 ℃延伸10 min。扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分离,然后进行目的条带回收和测序。

表1 本研究所用的引物

采用CTAB法提取扬麦17的基因组DNA(gDNA),以此为模板,扩增TaRD21基因的全长片段。所用引物以及PCR扩增体系和扩增程序同上。

1.4 TaRD21基因的染色体定位

根据三个TaRD21基因的gDNA序列,在序列差异较大的内含子区域设计特异引物clTaRD21-F/R(表1),利用整套小麦缺体-四体对TaRD21基因进行染色体定位分析。

1.5 序列分析和同源性比对

用NCBI在线分析工具ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)预测基因的开放阅读框;用SMART在线软件(http://smart.embl-heidelberg.de)对编码蛋白的结构域进行分析;用ProtParam在线软件 (http://expasy.org/tools/protparam.htm1)分析编码蛋白的理化性质;用SOPMA软件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_sopma.html)对编码蛋白的二级结构进行预测;用TMHMM软件(https://cbs.dtu.dk/service.php/TMHMM-2.0)进行跨膜结构预测分析;用DNAMAN软件进行多序列比对,用MEGA 5.0软件构建系统进化树。

1.6 TaRD21基因的表达模式分析

根据TaRD21基因序列,设计特异的qRT-PCR引物qTaRD21-2A/2B/2D-F/R(表1),以SA和ETH处理的幼苗cDNA以及接种赤霉病菌的颖壳cDNA为模板,以无菌水处理为对照,利用BioRad CFX96TM实时荧光定量PCR仪检测目的基因的表达模式。内参基因为β-Actin。按照SYBR Primix ExTaq试剂盒(TaKaRa,北京)说明书配制PCR反应体系。反应程序:95 ℃ 30 s;95 ℃ 10 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 20 s,40个循环。采用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量。每个样品设3个重复, 每次处理有3个生物学重复。用DPS7.05软件进行差异显著性分析(LSD法)。

2 结果与分析

2.1 TaRD21基因的克隆和蛋白结构分析结果

以TaRD21-F/R为引物,以接菌72 h后的小麦(扬麦17)颖壳cDNA为模板进行PCR扩增,获得一个大约1 400 bp的片段(图1)。测序分析发现,共获得三个长度分别为1 419、1 410和1 428 bp的cDNA片段,分别编码472、469和475个氨基酸。同时以TaRD21-F/R为引物,以扬麦17的gDNA为模板进行PCR扩增,获得一个大约3 500 bp的片段(图1),经回收与测序,发现其包含三个不同长度的TaRD21基因序列。

M: Trans2K DNA marker.

2.2 TaRD21基因的染色体定位

以clTaRD21-F/R为引物,以中国春第二同源群缺体-四体的gDNA为模板,进行基因染色体定位分析。结果显示,以N2A/T2B、N2A/T2D的gDNA为模板时,扩增结果缺少229 bp的片段;以N2B/T2A的gDNA为模板时,扩增结果缺少264 bp的片段;以N2D/T2A的gDNA为模板时,扩增结果缺少351 bp的片段。因此,将三个TaRD21基因定位在小麦第2同源群染色体上(图2),并分别命名为TaRD21-2A、TaRD21-2B和TaRD21-2D。定位结果与小麦基因组数据库预测分析结果一致。

1:中国春;2:扬麦15;3:扬麦17;4:N2A/T2B;5:N2B/T2A;6:N2A/T2D;7:N2D/T2A。

2.3 TaRD21基因的生物信息学及二级结构分析

用NCBI在线工具ORF Finder分析发现,三个TaRD21基因均含有 5 个外显子和4 个内含子(图3A)。用SMART软件分析发现,三个TaRD21蛋白均含有N端信号肽(signal peptide)、自抑制结构域(auto-inhibitory domain)、蛋白酶结构域(protease domain)和C端颗粒蛋白结构域(granulin domain),其中C端颗粒蛋白结构域大约包含60个氨基酸,含有14个保守的Cys结构(Cx5Cx5CCCx7Cx4CCx6CCx5CCx6Cx6C)(图3B和图4),属于典型的PLCPsRD21亚族。用ProtParam软件分析发现,三个TaRD21蛋白分子量在50.4～50.9 kD之间,等电点在5.41～5.71之间,表面带负电荷的氨基酸均有57个,表面带正电荷的氨基酸有47～49个,为脂溶性的疏水蛋白,均含有跨膜结构,其二级结构均包含α螺旋、延伸链、β折叠和无规则卷曲在TaRD21-2A蛋白中占比为26.48%、4.87%、52.54%和16.10%;在TaRD21-2B蛋白中占比为23.88%、4.48%、53.73%和17.91%;在TaRD21-2D蛋白中占比为24.63%、5.26%、53.68%和16.42%。

A:TaRD21基因结构示意图;B:TaRD21蛋白的保守结构域。

下划线分别代表TaRD21蛋白的4个保守结构域;绿色线为信号肽;粉色线为自抑制结构域;蓝色线为蛋白酶结构域;红色线为颗粒蛋白结构域;黑色点为保守Cys。

2.4 TaRD21基因的同源性比对及进化分析

利用DNAMAN软件对三个TaRD21基因及TaRD21蛋白的氨基酸序列进行比对,发现三个基因的DNA序列相似性为89.3%;三个TaRD21蛋白的氨基酸序列相似性为95.6%,差异较大的区域为信号肽结构域,而其他3个结构域序列保守性较高(图4)。为进一步研究TaRD21基因在不同物种中的进化情况,利用MEGA 5.0软件构建小麦TaRD21蛋白与水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)、大麦(Hordeumvulgare)、乌拉尔图小麦(Triticumurartu)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)和菠萝(Ananascomosus) RD21蛋白的系统进化树,发现小麦TaRD21蛋白与双子叶植物拟南芥、菠萝的RD21蛋白同源性较低,但与单子叶植物水稻、玉米、大麦和乌拉尔图小麦的RD21蛋白同源性较高;TaRD21-2A蛋白与小麦A基因组起源物种乌拉尔图小麦TuRD21A蛋白的同源性高于TaRD21-2B和TaRD21-2D蛋白(图5)。

括号中为RD21蛋白的 GenBank 登录号,进化树分支上的数字为Bootstrap值。

2.5 TaRD21基因的表达模式分析

2.5.1TaRD21基因在不同激素胁迫下的表达模式

从图6可以看出,抗赤霉病小麦品种扬麦17和感赤霉病小麦品种扬麦15中,三个TaRD21基因均受SA和ETH诱导表达,且具有明显差异。扬麦17中TaRD21-2B和TaRD21-2D的表达量总体高于扬麦15;而扬表15中TaRD21-2A基因的表达量总体上高于扬表17中该基因的表达量。在扬表17中,TaRD21-2B和TaRD21-2D基因对ETH的响应更为迅速,分别在诱导4和2 h后达到峰值;在扬麦15中,TaRD21-2A基因对SA的响应更为迅速,在诱导4 h后表达量达到峰值。表明TaRD21基因的表达受SA和ETH调控,但在抗、感赤霉病小麦品种中表现不同。

图柱上不同字母表示在0.05水平差异显著。下同。

2.5.2TaRD21基因在赤霉病菌诱导下的表达模式

从图7可以看出,接种赤霉病菌后,扬麦17和扬麦15中三个TaRD21基因均上调表达,其中扬麦17中TaRD21-2B和TaRD21-2D基因对赤霉病菌响应迅速,均在接种12 h后表达量达到峰值,显著高于扬麦15中这两个基因的表达量;而TaRD21-2A基因的表达量在接种48 h后才达到峰值,对赤霉病菌的响应表现比较迟缓。在扬麦15中,TaRD21-2A基因的表达量在接种后逐渐升高,并在接种24 h后达到峰值,此后表达量虽然有所下降,但仍维持较高水平,并显著高于对照(接种0 h)处理;TaRD21-2B和TaRD21-2D基因的表达量在接种12 h后无显著变化,在接种24～72 h后均显著高于对照(接种0 h)处理。

图7 赤霉病菌诱导下TaRD21基因在不同抗性小麦品种中的表达模式

3 讨论

本研究发现,3个TaRD21基因都存在信号肽、自抑制区、蛋白酶和颗粒蛋白结构域,具有典型的PLCPs家族特征。通过进化分析发现,3个TaRD21基因与禾本科植物RD21基因聚在一个大分支上,且与乌拉尔图小麦、大麦RD21基因亲缘关系最为接近,说明禾本科植物的RD21基因进化相对保守。TaRD21-2A与小麦A基因组祖先物种乌拉尔图小麦的RD21基因序列同源性更高,进一步表明RD21基因在小麦进化过程中非常保守。

植物内源蛋白酶PLCPs在植物免疫调节中发挥重要作用,编码PLCPs的基因缺失会削弱植物的免疫反应[8]。如:拟南芥缺失突变体rd21在接种灰霉菌(Botrytiscinerea)后更易感病[14];拟南芥缺失突变体rd19在接种茄科青枯劳尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)后抗病性丧失[18];烟草中RD21同源基因C14沉默后,烟草对致病疫霉(Phytophtthorainfestans)的抗病性减弱[16]。另外,PLCPs也是依赖水杨酸(SA)的防御信号传导的关键调控因子。Ziemann等[19]研究表明,PLCPs是SA调控植物免疫信号通路中的一个重要组分,发挥正向调节作用。一般认为,SA介导的系统获得抗性(SAR)反应主要对活体营养型病原菌起作用,而JA、乙烯(ET)介导的抗病信号途径对抵抗死体营养型真菌的侵染起重要作用[20]。引发小麦赤霉病的禾谷镰刀菌是一种半活体营养型真菌,因而小麦赤霉病抗病机制较为复杂。本研究通过qRT-PCR技术分析了SA、ETH处理及接种赤霉病菌条件下3个小麦TaRD21基因的表达情况,发现SA和ETH均能显著诱导TaRD21基因上调表达,但在抗、感赤霉病小麦品种中,3个基因的表达模式有差异。在抗病品种中,TaRD21-2B和TaRD21-2D基因对ETH的响应更迅速,同时也受赤霉病菌诱导表达,推测这两个基因可能参与ETH介导的赤霉病抗性反应;而在感病品种中,TaRD21-2A基因对SA及赤霉病菌的响应更为快速,推测TaRD21-2A可能与感病性相关,即在小麦与赤霉病菌互作中发挥负调控作用。已有研究表明,RD21基因与细胞死亡的前体信号相关,而引发细胞死亡是促进死体营养型真菌迅速侵染的重要途径。拟南芥通过RD21负调控霉菌毒素FB1,提高了拟南芥对死体营养型串珠镰刀菌(Fusariummoniliforme)的抗性[13],表明RD21是拟南芥死体营养型串珠镰刀菌的隐性感病基因。TaRD21-2A基因在小麦与赤霉病菌互作中是否行使类似的功能,有待通过基因编辑敲除该基因,深入研究该基因的功能。