手掌接触性生物检材DNA 检出率与汗孔密度的相关性研究

敖健恒，缪 磊，王慧颖，章天云，王 涛，唐永行，胡利平，聂胜洁

（昆明医科大学法医学院法医学系，云南 昆明 650500）

接触性生物检材是指人体皮肤（或粘膜）与物体接触之后所形成的生物检材类型[1]，这类检材在法医物证检案中较为多见，其在个体识别、亲缘鉴定、侦破案件、提供证据等方面具有显著的应用价值。接触性生物检材的DNA 来源有多种，如皮肤（或粘膜）的脱落细胞及二次转移等，其中脱落细胞是该类生物检材中DNA 的主要来源[2]，但除了胞内DNA，还存在一定比例的胞外游离DNA[2]。接触性DNA 是目前法医学实践研究的热点，但由于各类检材的接触性DNA 检出率较低且差异较大，缺乏对结果的科学、合理的证据解释，这将影响案件的侦破，且难以在法庭活动中对相关专业性的问题给出科学合理的解释，因此检出率的影响因素一直是国内外研究的难点问题。个体差异、检材形成方式、载体类型、检验方法等是影响接触性DNA 检出率的主要因素[3]，目前多集中在方法学方面的研究，即针对检材的转移、DNA 的提取纯化、检测平台的选择等，而从个体差异的角度来解释检出率差异的报道较为少见。

相关研究认为，在细胞外有部分降解的DNA来自于凋亡的上皮细胞[4]、皮脂腺[5]或汗腺[6]，它们被认为对皮肤接触样本的DNA 含量有显著贡献。van den Berge 的研究中[7]阐述，当比较每个供体收集的2 种皮肤类型时，皮脂腺皮肤样本总是有着比非皮脂腺皮肤样本更高的DNA 含量（高2.6～186 倍）；在比较16 名志愿者跑步前与跑步后、未出汗与出汗的左右手共64 个样本时，跑步后出汗手样本DNA 含量更高，最高为未出汗时的153.6 倍[7]。而汗孔是汗腺在皮肤表面的开口，是汗液排泄的通道，Quinones 等[6]研究表明，1 mL 无细胞汗液样本中可以获得平均11.5 ng 的游离DNA，说明汗液中游离DNA 是手掌接触性DNA 的构成要素之一。

汗孔作为皮肤的结构之一，是开展手掌接触性DNA 相关研究的理想变量因素。因此本研究提出了手部接触性生物检材的DNA 检出率与汗孔密度或有一定的相关性的假设，选择男性手掌汗孔密度作为研究变量，探索其与接触性生物检材的DNA 检出率的相关性，以期为接触性生物检材的差异性DNA 检出率的结果解释提供参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象

本研究的受试对象为73 名男性大学生，年龄为18～21 岁，受试者手掌皮肤无疤痕，无手癣、皮炎、湿疹等皮肤疾病。本次研究于2021 年5 月进行，样本的收集获得受试对象的知情同意并已获得昆明医科大学伦理委员会批准。

1.2 受试者汗孔密度显现及观测

在受试者右手小鱼际处均匀涂抹手霜后粘贴定位标志，于手机屏幕（含钢化玻璃贴膜）上平行捺印3 个掌印，使用匀光电筒侧光照射手机屏幕，并用15 倍微距镜头在固定高度的台架上拍摄掌印照片。若掌纹汗孔采集不合格，则运用同样的方法采集受试者右手拇指的指印。运用Adobe Photoshop Lightroom Classic CC 7.3 软件对拍摄的图像进行曝光度、对比度、清晰度、纠正镜头畸变等调节，以去除不必要的颜色、噪点或畸变干扰，并用Adobe Illustator CC 22.1 软件制作汗孔计数模板（图1）。利用微距镜头对比例尺的拍摄，将图像所对应的实际尺度同步到了模板之中，以便于后期划定范围与汗孔计数。利用定位标志和掌纹特征点寻找掌纹相同区域并划定计数范围，并利用软件对平行捺印的3 个掌印中的每枚掌印4 mm×4 mm 范围内的汗孔进行计数（图1）。按照掌（指）印上汗孔的清晰程度分为合格（图2A）与不合格（图2B），每枚合格掌（指）印的汗孔由两名实验人员分别计数，若计数结果相对偏差大于15%，则由第3 名实验人员进行计数，将其中相对偏差较小的2 次计数结果纳入统计。

图1 掌纹汗孔计数方案示意Fig.1 Palmprint sweat pore counting scheme

图2 汗孔采集显现的相关情况Fig.2 Relevant situation on sweat pore collection and display

1.3 DNA 样本采集

在掌印汗孔捺印合格的受试者中选取35 名开展后续实验，实验环境温度控制在16～22 ℃，相对湿度保持在45%。受试者清水洗手1 min，自然晾干，实验过程中情绪稳定且无剧烈运动。采集受试者口腔拭子作为比对样本，干燥后用纸质物证袋保存。

本次实验采用2 种不同的方法转移受试者的手掌接触性DNA：（1）直接转移法：在受试者左手小鱼际处用油性笔标记3 个1 cm×1 cm 大小的区域，戴薄膜手套20 min，摘除手套后用3 片1 mm×1 mm 的湿润滤纸片分别擦拭上述3 个区域内的皮肤表面，并分别装入不同的200 µL 的EP 管中；（2）载玻片转印间接转移法：受试者左手佩戴薄膜手套20 min（并没有和直接转移法同时进行），摘除手套后在小鱼际处放置一块洁净的载玻片，将1.35 kg 的物体（以控制压力变量[8]）垂直作用玻片表面，用1 mm×1 mm 的湿润滤纸片在2.5 cm×2.5 cm 范围内转印有掌纹的载玻片上擦拭，并装入200 µL EP 管中。

1.4 PCR、电泳及STR 分析

运用21Plex 荧光检测试剂盒（沿溯）对转移后的手掌擦拭样本和比对样本进行直接扩增，每管中分别加入Mater Mix 4 µL，Primer Mix 2 µL，H2O 4 µL。手掌擦拭物的扩增参数：96 ℃ 1 min；94 ℃10 s，59 ℃ 1 min，31 个循环；60 ℃延伸20 min；4 ℃保存。比对样本的扩增参数：96 ℃ 1 min；94 ℃ 10 s，59 ℃ 1 min，27 个循环；60 ℃延伸20 min；4 ℃保存。扩增产物在ABI 3130 型遗传分析仪上电泳，用GeneMapper ID-X 1.5 软件进行STR 分型，等位基因峰高阈值为30 RFU。

1.5 统计学处理

运用Microsoft Excel 2019 对等位基因检出率和汗孔密度进行统计和计算，运用IBM SPSS Statistics 26.0 软件对掌印汗孔密度及2 种转移方法的等位基因检出率分别进行相关性分析。

2 结果

2.1 汗孔采集结果

51 名受试对象掌印汗孔采集合格，11 名受试对象指印汗孔采集合格，汗孔采集总体合格率为84.93%。手掌汗孔密度为（531.41±97.69 ）个/cm2，最小值为309 个/cm2（图2C），最大值为814 个/cm2（图2D），掌印汗孔密度分布见图3；指纹汗孔密度为（627.04±182.13 ）个/cm2，最小值为200个/cm2，最大值为869 个/cm2。

图3 掌印汗孔密度频数分布图及其正态分布曲线Fig.3 The frequency distribution diagram and normal distribution curve of palmprint sweat pore density

2.2 DNA 检验结果

对上述样本使用21Plex 荧光检测试剂盒（沿溯）进行PCR 复合扩增，阴性对照未检出特异性扩增产物，阳性对照基因分型正确，图为受试者的口腔拭子（图4A）和实验样本的DNA 分型图（图4B）。

图4 毛细管电泳DNA 分型结果图谱Fig.4 Capillary electrophoresis DNA typing result chart

参照比对样本进行手掌检材的等位基因计数，采用直接擦拭法和载玻片转印间接擦拭法进行手掌DNA 检验的结果见表1。其中采用直接擦拭法和载玻片转印间接擦拭法所得到的平均等位基因检出个数分别为25.36 个和23.86 个，等位基因平均检出率分别为63.40%和59.64% 。

表1 2 种手掌接触性生物检材转移方法的DNA 检出结果Tab.1 DNA detection results of two transfer methods for palm touch biological samples

2.3 统计学结果

35 名受试对象按手掌汗孔密度平均值分为汗孔密度较小（σ≤523 个/cm2）和汗孔密度较大（σ ＞ 523 个/cm2）2 组，并统计各组的STR 等位基因检出数。经分析，2 种擦拭方法得到的不同汗孔密度的STR 等位基因检出数结果见表2，2 组的DNA 检出结果差异无统计学意义，P值分别为0.825 和0.941（表2）；对35 名受试对象的手掌汗孔密度和直接擦拭法STR 等位基因检出率进行统计学分析，发现两者之间不存在相关性关系（P1=0.806，图5A）；对35 名受试对象的手掌汗孔密度和间接擦拭法STR 等位基因检出率进行统计学分析，发现两者之间不存在相关关系（P2=0.701，图5B）。

表2 2 种手掌接触性生物检材转移方法的DNA 检验结果与掌印汗孔密度统计比较Tab.2 Comparison of DNA test and palmprint sweat pore density between two trasferring methods of palm touch biological samples

图5 掌印汗孔密度与等位基因检出率的散点图Fig.5 Scatter plot of sweat pore density and allele detection rate in palmprint

3 讨论

3.1 掌纹显现与汗孔计数模型建立

在基层实践中，一般使用油墨捺印法、活体指纹采集仪法和扫描仪法等采集指纹，左琦[9]的研究表明以上几种方法对指（掌）纹中汗孔的显现情况不佳，或需要价格较昂贵、技术含量较高的设备[10]（如谱域光学相干断层扫描成像系统等）对指（掌）纹的汗孔进行清晰显现与采集。本次实验中笔者通过合理地设计并利用了一个耗材损耗少、实施容易、数据电子化方便的方式建立了实验模型，采用了简单的装置实现了掌纹汗孔显现，并利用图像处理软件对汗孔进行清晰显现与人工计数。本方案具有方法简单、技术壁垒低、低成本、效果好的特点，十分有利于汗孔相关研究的开展，也可用于解决基层刑侦工作中难以捺印提取的指掌纹汗孔形态或其他3 级特征信息等相关问题。此模型的建立，为法医学实践中指掌纹的显现、汗孔计数、汗孔形态学观察以及相关的遗传学研究提供了技术支撑。

3.2 实验质量控制

在本次实验中，笔者尽可能地控制了除汗孔密度之外的变量因素。如受试对象的性别[11-12]及年龄[13-14]、参与实验时的情绪以及运动状况、实验环境温度与湿度[15-16]等。有研究者指出：事前的活动[17]（如洗手[18]、抚摸或玩弄头发[11]、导致出汗的身体活动[7]）可能会增加转移DNA 的量；皮肤状况（例如双手极度干燥，或皮肤病等）会影响转移DNA 的量[19]，所以笔者征集了健康的男性大学生作为受试者，并在实验前要求受试者清水洗手1 min 后自然晾干，以尽可能减少手掌上原有分泌的DNA、易脱落细胞、他人背景DNA[17]的影响。实验过程中未与除薄膜手套内壁和实验载体之外的物体接触，可以排除DNA 二次转移对实验结果的影响。在直接转移法采集手掌生物检材的操作中笔者设计了重复试验，以减少其他的变量影响；在利用二次转移法时控制了压力变量[8]和采样面积，以控制实验变量。

本次实验通过2 种不同的实验方法对手掌接触性生物检材进行DNA 检验，均表明手掌汗孔密度与接触性DNA 的检出率无相关性，说明汗孔密度不是接触性DNA 检出率的主要影响因素，或不是其唯一影响因素。

在多项研究中指出，接触性生物检材的DNA主要来自于脱落细胞[2,20]，本次实验采用擦拭法转移手掌接触性生物检材，并对所转移的检材进行直接扩增，而未将脱落细胞DNA 检验和游离DNA 的检验分开进行研究，因此会受到个体脱落细胞含量差异的影响，未能在严格控制变量的情况下直接反映汗孔密度和接触性生物检材DNA 检出率的单一相关性，这可能是导致无相关性实验结果的主要原因之一。同时，除了汗孔密度外，每个人的汗腺分泌功能的差异会有区别，不能简单的将汗孔密度作为因变量。但值得注意的是，非角化的有核细胞仍有可能从汗管中脱落[6,21]，如不只单独地考虑汗液中的游离DNA，汗孔密度也有一定程度的可能影响接触性生物检材中脱落细胞的含量，从而影响DNA 检出率。虽然我们尽可能地控制了一些变量，但受试者可能受到其他难以被评估的变量干扰而导致实验结果受到影响。

基于上述分析，本项目在未来仍具有较大的研究价值，实验设计需要从以下几个方面进行优化：（1）更严谨的控制变量。尽管关于转移DNA的研究总是受到大量（相互作用）的变量影响[17]，但仍可以通过控制主要的影响因素从而继续深入研究，如对提取到的检材采取离心的方式去除可能存在的脱落细胞；（2）选取更合适的实验对象。Oleiwi 的研究指出[22]从手掌表面脱落的DNA 数量明显少于两个手指脱落的DNA 数量，或可以转而研究手指的汗孔密度与接触性DNA 检出率的关系；（3）扩大研究样本。本次实验的样本例数较少，个体差异将会对实验结果有较大的影响，可以通过扩大样本来进一步寻找在广泛人群中存在的规律；（4）利用更科学，更先进的方法对汗孔进行可视化与计数。借助更先进的指纹显现技术，可以提高汗孔显现的成功率，也使得我们可以从更细致的方面研究汗孔和接触性DNA 之间的关系。如有条件，对汗孔的计数的工作可以采用计算机视觉深度学习的方法训练相关模型以实现自动识别[23]，以便于在对更大量样本的研究中减少工作量与负担，同时促进方案的实际应用。

随着实验方法的不断优化，检测平台的持续升级（如采用二代测序技术），接触性生物检材的DNA 检出率与灵敏度会逐渐增加。如何对DNA遗留机制给出科学合理的证据解释，是案件侦破和法庭诉讼的重点。汗孔是汗腺在皮肤表面的开口，是汗液排泄的通道，因此探索汗孔密度与汗液分泌量的关系、汗密度和游离DNA 的含量是否存在相关性，可以成为下一步研究的关注点。同时，对从汗孔中分泌的化学物质或遗传物质的分析已成为新的关注点[24-25]，将指纹的三级特征（如汗孔等）与接触性DNA 检测进行结合或可以提高个体识别的成功率，同时也为后续研究者研究指纹特征与接触性生物检材的关系提供了新的方向和思路。