高效液相色谱仪测定大豆油中苯并(a)芘含量的不确定度评定

◎ 刘 瀛，许文雅，肖舒元，王 韵，郁蕉竹，林 洋

（沈阳市食品药品检验所，辽宁 沈阳 110122）

苯并(a)芘（又称3，4-苯并芘，以下简称为BAP）属于多环芳烃类化合物（PAHs），它是我们日常生活中相当常见的一种高活性致癌物，目前已被世卫组织确定为三种强致癌物之一[1]。BAP不仅广泛存在土壤等环境中，还可能通过食物或饮用水进入人体内，被人体吸收进入肠道，通过血液循环快速遍布人体各个部位，对人们的身体造成严重伤害[2]。

BAP具有较强的脂溶性，这导致大豆油等植物油类食品极易遭受BAP的污染[3-4]，当前在国内外的植物油样品中均有检出BAP[5]。植物油的BAP项目已经成为食品中特别关注的指标[6]，GB 2762—2017《食品安全国家标准 食品中污染物限量》中明确规定，油脂BAP的限量指标为10 μg/kg[7]。

测量不确定度是评定检测结果精度的一项重要指标，它能够直观地反映测量结果的准确性与可信度，同时也对测定结果的判定提供了参考[8]。本文参照食品安全国家标准GB 5009.27—2016[9]检测大豆油中的BAP，并根据JJF 1059.1—2012[10]对其测定结果进行不确定度的评定。通过分析致使检验结果存在误差的各种因素，得到各不确定度分量，合成相对不确定度以及扩展不确定度，从而提高大豆油中苯并(a)芘检测精准度，对提高测量结果质量等提供指导思路[11]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

BAP标准品（纯度99.0%）：德国DR 公司；大豆油试样（市售）；BAP分子印迹柱：上海安谱公司；正己烷（色谱纯）：Sigma-Aldrich公司；二氯甲烷（色谱纯）：Thermo-Fisher公司；乙腈（色谱纯）：国药。

1.2 仪器

电子天平：Sartorius赛多利斯；高效液相色谱仪（E2695配备荧光检测器2475）：Waters；多试管涡旋混合器：DMV-16，广东科寅实验室设备有限公司；M64平行浓缩仪：LabTech公司；移液器：德国Brand。

1.3 试验方法

1.3.1 标准溶液的配制

称取BAP标准品0.001 03 g于10 mL容量瓶中，用甲苯溶解并定容，此溶液为BAP标准储备液（103 mg/L）。用乙腈将储备液稀释成1.03 μg/mL的标准中间液，再用乙腈逐级稀释配制成0.515 μg/L，1.03 μg/L，5.15 μg/L，10.3 μg/L，20.6 μg/L的系列标准工作溶液。

1.3.2 样品处理

称取0.500 g试样，加入正己烷旋涡混匀，转移至已用正己烷和二氯甲烷活化的BAP分子印迹柱，用正己烷淋洗柱子并弃去，CH2Cl2洗脱。收集用氮气吹干， 0.5 mL乙腈复溶，旋涡后过微孔滤膜待测。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（88∶12，v/v）；激发波长384 nm，发射波长406 nm；进样量：20 μL；柱温：35 ℃；流速：1.0 mL/min。

2 数学模型的建立及不确定度来源分析

2.1 建立数学模型

BAP含量结果以μg/kg表示，保留小数点后一位，其数学模型为：

式中，X——样品中BAP的含量；P——被测组分浓度（μg/L）；V——定容后的样体积（mL）；m——所称样品重量（g）；1 000为单位换算因子。

2.2 不确定度来源分析

以数学模型为基础进行分析，结合实际检测步骤，发现测定的大豆油BAP含量的不确定度主要来自以下几个方面：

①样品的称量。②样品的提取和定容。③标准溶液的配制和稀释。④标准曲线拟合。⑤样品测量重复性。

3 结果与分析

3.1 样品称量引入的不确定度

本方法中称样量m样为0.500 g，根据所使用的电子天平的检定证书，其称量引入的不确定度按B类评定，则α=0.005 g，属于均匀分布，则标准不确定度；所引入的不确定度分量为：

3.2 样品定容引入的不确定度

样品经溶剂溶解、分子印迹柱净化、氮吹浓缩后，最后定容用0.5 mL乙腈，其温度变化可忽略不计，根据其校准证书（500±5 μL），按均匀分布，则

实验室温度20 ℃±5 ℃，在此条件下，乙腈膨胀系数为1.37×10-3/℃，则

由于两个分项是独立不相关的，合并两分项计算。因此，样品前处理过程中定容引入的不确定度分量为：

3.3 制备标准溶液时引入的不确定度

配制BAP标准储备液，并逐级稀释配制标准工作液。此操作步骤中的不确定性很大程度上来源于标准物质纯度、标准物质称量、标准物质配制及稀释过程。

3.3.1 标准物质纯度引入的分量

BAP标准品证书上注明了其纯度为99.03%，相对扩展不确定度U=±0.35%（k=2），则

3.3.2 标准物质称量引入的分量

由于本实验室所用电子天平的最大允许误差为±0.5 e即±0.000 05 g，则α=0.000 05 g。视为均匀分布，称取BAP标准品0.001 03 g，则

3.3.3 标准储备液配制引入的分量

3.3.3.1 容量瓶体积引入的不确定度

根据10 mL容量瓶检定证书（允差10±0.02 mL），近似于三角形分布（属B类评定，则其标准不确定度为

3.3.3.2 标准储备液配制温度变化引入的不确定度

根据容量瓶检定证书，容量瓶的检定温度为24 ℃，本实验室温度在20 ℃±5 ℃范围内波动。在20 ℃温度下，玻璃的膨胀系数值为2.5×10-5/℃，而甲苯的膨胀系数数值为1.08×10-3/℃，容量瓶的体积膨胀值要小得多，只需要考虑液体的体积膨胀。因此，体积变化为±10 mL×5℃×1.08×10-3/℃=±0.054 mL，其标准不确定度为则10 mL容量瓶引入

因此标准储备液配制过程的

3.3.4 标准溶液稀释过程引入的分量

标准溶液稀释过程中的不确定度分量主要来自两个方面：移液器的使用和容量瓶的引入。

3.3.4.1 移液器（50 μL、200 μL）引入

表1 标准溶液稀释所使用的移液器体积及其相对不确定度表

3.3.4.2 容量瓶引入

根据容量瓶的检定证书，计算得到容量瓶体积及温度变化所引入的相对标准不确定度见表2。

表2 容量瓶所引入的相对标准不确定度表

综上计算得：

合并两项计算，标液配制过程所引入的

3.4 标准曲线拟合引入的分量

将配制好的BAP标准工作液依次注入高效液相色谱仪进行测试，绘制标准曲线为：Y=1 201 774X+7 295.2，R2=0.999 989。标准曲线浓度及峰面积结果见表3。

表3 标准曲线浓度及峰面积结果表

式中，n=5，为标准曲线的测量次数即曲线浓度点数。样品平行测定6次，质量浓度分别为5.882 μg/L，6.005 μg/L，5.622 μg/L，5.954 μg/L，5.771 μg/L，5.582 μg/L，求得平均质量浓度为C0=5.803 μg/L，其峰面积残差标准偏差及其它相关数据见表4。

表4 标准曲线相关数据表

则C0的标准不确定度为：

3.5 样品测量重复性因素引起的不确定度

对样品重复称量6次进行平行测定，结果见表5。测定结果的平均值为相对标准偏差为

表5 苯并(a)芘含量重复性试验结果表

按A类评定进行计算，则相对标准不确定度

3.6 合成不确定度

3.6.1 标准不确定度

将各部分分量最终所合成得：

3.6.2 扩展不确定度

在95%置信水平下取k=2，扩展不确定度

4 结语

通过对大豆油中BAP含量的各不确定度分量进行评定，发现大豆油中BAP含量为X=（5.7±0.54）μg/kg（P=95%，k=2）。经过分析，确定BAP含量测定过程中可以不确定度的来源主要是试样称量、样品最终的定容操作、配制和稀释标准溶液过程、标准曲线的拟合、测量重复性5个方面，其中标准溶液的配制和稀释以及测量的重复性对合成标准确定度的影响相对较大。基于此，在实际检测过程中，为了降低测试的不确定度，需要严格把控检测标准溶液的配制过程，选择等级较高的标准物质和精度较高的量具，对标准物质按时进行期间核查，精确配制和稀释标准溶液；此外，要加强人员的监督和培训，尽量减少人为误差，同时注重仪器的维护与保养，定期进行仪器检定校准和期间核查，以及增加样品平行测定次数等，以保证检测结果的准确性，降低测量的不确定度。