抗氧化性豌豆蛋白肽的分离制备工艺研究

◎ 张树成，隋杨林，杨进洁，蒋金栓，赵 收

（烟台双塔食品股份有限公司，山东 招远 265400）

豌豆（Pisum sativum Linn）又名青豆、寒豆、荷兰豆，是一种豆科植物，一年生或越年生[1-2]。豌豆可作为蔬菜，饲料，甚至主粮[3-4]。豌豆中富含淀粉、蛋白质、膳食纤维等。其中，淀粉占比在48%左右，蛋白质占比在22%左右，膳食纤维占比在15%左右。豌豆淀粉是优质淀粉，主要用于加工龙口粉丝、凉粉等。相比谷类和薯类淀粉来说，豌豆淀粉的直链淀粉含量较高，这也是形成龙口粉丝特有品质的关键所在。豌豆蛋白是淀粉提取的副产物，其蛋白质氨基酸组成比较丰富，氨基酸评分能达到0.8以上。除含硫氨基酸外[5]，其他必需氨基酸的含量水平都较高，特别是赖氨酸含量高达 7.2%，是良好的必需氨基酸来源[6]。近几年，国内和国际上对豌豆蛋白利用场景越来越多样化，对豌豆蛋白的研究也越来越深入。

蛋白酶是由传统食品加工用微生物菌株和确认无害的菌株生产，中性蛋白酶的生产菌株主要是枯草芽孢杆菌[7]。中性蛋白酶能在适宜的条件下将蛋白质大分子水解成蛋白质胨、多肽、氨基酸等。目前，中性蛋白酶被广泛应用于洗涤剂、制革、发酵和酿造、蛋白质的水解以及功能肽等生产工艺中。

本研究旨在采用中性蛋白酶将豌豆蛋白粉酶解，测定其酶解产物豌豆蛋白肽的抗氧化活性的变化。通过控制酶解反应的温度、时间、pH和底物浓度4个条件，优化出最佳酶解反应参数，并以·O2-自由基清除率作为豌豆蛋白肽的抗氧化活性的评价指标。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

中性蛋白酶：购自诺维信（中国），酶活力为4.5×104U·g-1。

豌豆蛋白：烟台双塔食品股份有限公司自产，蛋白质含量在80%～85%。

1.2 仪器与设备

SHA-BA数显水浴恒温振荡器；TD5M型离心机；N-1300型旋转蒸发仪；T6新世纪型紫外可见分光光度计。

1.3 豌豆蛋白的酶解方法

将一定质量的豌豆蛋白粉用清水溶解后，用磷酸盐缓冲液调整pH。加入设定比例的中性蛋白酶后，恒温震荡酶解3 h，沸水浴加热10 min灭酶。冷却后，将酶解液离心，保留上清液，其主要成分为豌豆蛋白肽。

1.4 最佳酶解参数确定

通过查阅相关资料文献，初步确定影响酶解效果的主要因素分别是加酶量、反应液的pH、反应温度和底物浓度。对这4个参数分别做单因素实验，再根据单因素实验结果设计正交实验。以酶解产物自由基·O-2清除率为衡量指标，来确定最佳酶解参数。

1.5 豌豆蛋白肽的提纯分离

采用不同孔径的透析袋，对豌豆蛋白酶解上清液进行依次分离。将上清液注入透析袋中，置于蒸馏水中搅拌透析，不断换水直至透析液颜色稳定无变化。对浓缩液进行浓缩和干燥，获得豌豆蛋白肽粉。

1.6 酶解产物自由基·O2- 清除率的测定[8]

取4.5 mL浓度在0.05 mol·L-1，pH为8.2的磷酸盐缓冲液于大试管中，在25 ℃水浴20 min后，加入1 mL豌豆蛋白肽样品和0.4 mL浓度为25 mmol·L-1的邻苯三酚溶液。摇匀后放回25 ℃水浴中反应5 min。随后加入1 mL 8 mol·L-1的盐酸终止反应，于325 nm下测反应液的吸光度A样。同时做空白对照A空。

1.7 酶解条件正交实验设计

以加酶量、反应液的pH、反应温度和底物浓度做4因素3水平正交实验。因素水平表见表1。

表1 酶解条件正交实验各因素及水平表

1.8 豌豆蛋白肽分子量测定

参照GB/T 22492—2008 大豆肽粉 附录A ，测定豌豆蛋白肽的分子量。

2 实验结果与分析

2.1 酶解条件单因素实验结果

豌豆蛋白使用中性蛋白酶酶解的不同反应参数（酶添加量、反应pH、反应时间和底物浓度）对反应后酶解产物的·O2-清除率的影响，分别由图1、图2、图3和图4表示。由图1可知，控制加酶量在6%~14%之间，酶解产物对·O2-清除率在10%左右有了快速提升，之后变化不明显。由图2可知，随着反应pH的升高，酶解产物对·O2-清除率先上升再下降，并且在pH为7左右时达到最高，且pH的影响较剧烈。由图3可知，随着反应温度的提升，酶解产物对·O2-清除率先快速上升，然后快速下降，当反应温度在40 ℃左右时，达到峰值。由图4可知，底物浓度越低时，酶解产物对·O-2清除率越高。但是，该参数要考虑到生产的实际成本控制，浓度越低，生产成本越高。结合实际，将该浓度控制在7%左右较为适宜。

图1 加酶量对酶解产物·O2-清除率的影响图

图2 反应pH对酶解产物·O2-清除率的影响图

图3 反应温度对酶解产物·O2- 清除率的影响图

图4 底物浓度对酶解产物·O2-清除率的影响图

2.2 酶解条件正交实验结果

由表2中极差分析结果可以看出，4个因素的影响主次顺序为：反应pH（B）＞加酶量（A）＞反应温度（C）＞底物浓度（D）。且最佳酶解参数为A3B2C2D1。即加酶量为12.0%，反应pH为7.0，反应温度为40 ℃，底物浓度为5.0%。由于该条件组合在实验中没有出现，所以，在该条件下做了3次验证实验，·O2-清除率分别为70.4%、71.5%、71.7%，平均值在71.2%，确实高于表中其他实验组，说明该组参数为最佳反应参数。可在该参数下进行抗氧化性豌豆肽的提升。

表2 酶解条件正交实验及结果分析表

2.3 豌豆蛋白肽的分离

采用透析袋对中性蛋白酶酶解产物进行分级提纯，获得不同分子量的豌豆蛋白肽，并对其进行·O2-清除率的测定，结果如表3所示。

由表3可知，中性蛋白酶的酶解产物经提纯后获得的豌豆蛋白肽，虽然分子量不同，但是都具有·O-2的清除能力，说明其具有抗氧化性。但是不同分子量的豌豆蛋白肽的抗氧化能力差距较大。随着分子量的降低，抗氧化能力会有快速提升的趋势。在分子量小于1 ku时，·O2-的清除能力最强。这与朱国洪等人的文献报道一致[9-10]。

2.4 豌豆蛋白肽小于1 ku组分的分子量分析

通过上述实验可知，豌豆蛋白肽在分子量小于1 ku时，能够表现出较强的抗氧化性。因此，对＜1 ku的分子量组成进行进一步的分析。标准曲线如图5所示。

校正曲线：Lg（MW）=7.390-0.250 T，R2=0.999 6

分子量小于1 ku的豌豆蛋白肽分子量分布图，如图6所示。

图6 豌豆蛋白肽分子量分布图

由图5和图6可知，将分子量小于1 ku的蛋白肽进一步分析，发现其分子量大多集中在200~800 U之间，在这个区间的肽往往是2肽到8肽。小分子量肽具有较高的氧化性。这与张秋萍等人的研究结论基本一致[10-11]。

3 结论

采用中性蛋白酶酶解豌豆蛋白，优化出·O2-清除率最高的酶解产物的参数即加酶量为12.0%，反应pH为7.0，反应温度为40 ℃，底物浓度为5.0%，在此条件下，·O2-清除率为71.2%。分级提纯后分析，发现分子量小于1 ku的豌豆蛋白肽的·O2-清除率最高，可达到79.3%，分析其分子量集中在200~800 U之间。说明透析技术能够达到提纯蛋白肽的目的，并且能够通过分级获得抗氧化能力较高的蛋白肽。分离出的抗氧化肽具有良好的抗氧化活性，可应用于食品防腐、清除自由基等多个领域。