梨多倍体种质资源的鉴定*

齐 丹，田路明，董星光，张 莹，霍宏亮，徐家玉，刘 超，张小双，詹俊宇，张思梦，曹玉芬

（中国农业科学院果树研究所，农业农村部园艺作物种质资源利用重点实验室，辽宁兴城 125100）

梨属植物以二倍体为主，但是多倍体种质也普遍存在，五大栽培梨系统中均有多倍体材料，如秋子梨系统的安梨、新疆梨系统的红那禾、白梨系统的海棠酥、砂梨系统的大叶雪、西洋梨系统的Cure等；梨野生种的原生种中没有发现多倍体，但是在次生种中的杏叶梨、木梨上发现了多倍体[1]。梨多倍体种质资源是进行梨种质创新的重要材料来源，近年来梨多倍体育种收获颇丰，如56-5-20 与乔玛杂交育成的三倍体品种龙园洋红[2]，大鸭梨与雪花杂交选育的三倍体品种华幸[3]，翠冠芽变选育的四倍体品种众翠[4]，沙01 与南果梨杂交育成的三倍体品种华香酥[5]和华香脆[6]。

植物多倍体的鉴定方法包括形态初选法[7]、细胞学方法（包括染色体计数[1]和细胞核DNA 含量测定[8]）、分子标记方法[9]。目前，梨种质资源倍性鉴定常用的方法为细胞学方法，流式细胞术在梨倍性鉴定和基因组大小估测上均有应用[10]，同时SSR 分子标记根据位点的等位基因数可作为倍性鉴定的依据[11]。本课题组在构建梨种质资源指纹图谱时发现，部分梨种质资源在至少1 个位点上扩增出3 个等位基因，部分材料在报道的文献中为二倍体，故与流式细胞术结合对梨种质资源进行倍性鉴定，增加倍性鉴定的准确度，以期发掘新的梨多倍体材料，为梨种质资源创新和遗传改良提供新材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为保存于国家果树种质兴城梨、苹果圃的100 份梨种质资源（表1），采集嫩叶进行SSR荧光分子标记和流式细胞术分析。

表1 供试梨种质资源

1.2 试验方法

采用CTAB 法提取梨基因组DNA，SSR 荧光标记引物选用本实验室筛选的17 对高多态性引物（表2），引物扩增及毛细管电泳参照张小双[12]的方法。用Attune NxT 流式细胞仪（Life Technologies 公司，美国）对梨种质的嫩叶进行染色体倍性检测[8]。

表2 供试高多态性引物序列

2 结果与分析

2.1 SSR 分子标记结果

使用17 对SSR 荧光引物对供试的100 份梨种质资源进行指纹图谱构建，ABI3730xl 遗传分析仪的毛细管电泳结果显示，100 份梨种质在至少1 个SSR 位点上扩增出3 个等位基因，其中41 份种质在1 个SSR 位点上扩增出3 个等位基因，11 份种质在2 个位点上扩增出3 个等位基因，5 份种质在3 个位点上扩增出3 个等位基因，43 份种质在4 个及以上位点上扩增出3 个等位基因（表3）。其中多摩1 个SSR 位点的3 个等位基因的电泳结果见图1。

图1 多摩3 个等位基因的毛细管电泳图

表3 供试梨种质资源扩增3 个等位基因的位点数及倍性评价

2.2 流式细胞术结果

通过查阅文献发现（表3），软儿、白皮洋、猪头、武威猪头、Cure、珍妮阿、黑酸梨、华香酥、华香脆、杏叶梨、敦煌香水梨、路易斯、玉璧林达、昆切克、沙疙瘩、大水核、卢卡斯、安古列姆、龙园洋红、红那禾、大叶雪、八月雪、皮胎果、海棠酥、安梨25 份梨种质是三倍体，甜酸、火把、棉梨、延边磨盘、面梨、红八里香、官红宵、武威香蕉、青皮钟、蜜香、长把酥、其力阿木提、骚梨、六月鲜、窝窝15 份梨种质是二倍体，沙01 是二、四倍体嵌合体或混倍体[1-2,5-6,8,10,13-18]。

用已知的二倍体棉梨作为对照，流式细胞仪测得染色体荧光强度值在50～55 区间出现较高的单峰。三倍体荧光强度值是二倍体的1.5 倍，在75～85 区间出现较高的单峰。依此判断，帕顿、武威麦梨、墨梨、多摩、秋洋、Tralezitsa、西洋梨×花楸、广河沙蛋梨、Summer stambol、陇西麻心、白果梨、保65-1、Dr Gyuiot、Beure Hardenpont、乐都软儿1号、Eldorado、临夏香把17 份种质经流式细胞术检测后，其倍性为三倍体，Harbo 种质经流式细胞术检测为二、三倍体嵌合体，这18 份种质在以往的文献中未见报道，为新鉴定出的梨多倍体种质。其力阿木提、骚梨、六月鲜、窝窝在已报道的文献中为二倍体，但在本研究中其扩增出3 个等位基因的SSR 位点较多，经流式细胞术鉴定，这4 份种质为三倍体（表3）。部分样品的流式细胞仪检测结果见图2。

图2 9 份梨种质资源叶片细胞的染色体荧光强度分布

SSR 荧光标记结果结合流式细胞术鉴定结果发现，在供试的100 份梨种质资源中鉴定出多倍体种质资源48 份（表3）。在1 个SSR 位点上扩增出3个等位基因的41 份种质均为二倍体；在2 个位点上扩增出3 个等位基因的11 份种质，鉴定出4 个三倍体和1 个二、三倍体嵌合体；在3 个位点上扩增出3 个等位基因的5 份种质，鉴定出3 个三倍体和1 个二、四倍体嵌合体；在4 个及以上位点上扩增出3 个等位基因的43 份种质，鉴定出39 个三倍体，只有Abate Fetel、红酥梅、贵妃、沂源1 号4份种质为二倍体。

3 讨论与结论

经流式细胞术鉴定，在17 个SSR 位点上扩增出3 个等位基因的100 份梨种质资源共发现多倍体种质资源48 份，其中已报道的三倍体梨种质资源25 份，二、四倍体嵌合体1 份，新鉴定出的三倍体梨种质资源17 份，二、三倍体嵌合体1 份，与已报道的倍性研究不一致的三倍体梨种质资源4 份，分别是其力阿木提[1]、骚梨[13]、六月鲜[15]、窝窝[1]。前人研究是使用去壁低渗法制备染色体标本，直接对染色体进行计数的方法，本研究中这4 份种质在指纹图谱中显示多个SSR 位点有3 个等位基因扩增，怀疑其为三倍体，再结合流式细胞术进行鉴定，理论上倍性鉴定结果应该是一致的，可见有必要对4 份存在争议的种质进行深入研究。在使用3 个及以上SSR 位点上扩增出3 个等位基因的48 份种质中，共计检测到43 份梨多倍体种质。可见随着扩增3 个等位基因的SSR 位点的增加，鉴定出的三倍体的数量也随之增加，单一的SSR 位点不能准确鉴定梨倍性，电泳结果多出的杂峰可能与仪器的毛细管污染有关，多个SSR 位点可提高鉴定的准确性。将SSR荧光标记技术与流式细胞术结合可准确鉴定梨种质资源的倍性，同时也对梨SSR 指纹图谱的杂峰进行剔除，提高了梨指纹图谱的准确度。

自然条件下多倍体植株的产生过程相对缓慢且较为罕见[19]。近年来，梨多倍体种质的人工选育收获颇丰，梨属植物的三倍体来自四倍体和二倍体的杂交[20]，四倍体与二倍体杂交可实现大规模制种，且从三倍体产生效率来看，2n 雌配子更有优势[21]。如近年育成的三倍体梨品种华幸、华香酥和华香脆，均采用四倍体种质作母本、二倍体种质作父本。梨属植物的四倍体通常来自芽变，有二倍体品种经芽变选育出四倍体品种，如翠冠的四倍体芽变品种众翠，鸭梨的四倍体芽变品种大鸭梨，也有利用秋水仙素离体诱变西洋梨品种产生的同源四倍体[22]。

培育多倍体植物会带来一些好处，会增加果实大小和增强植株抗性，但同时三倍体植物产生的不育花粉比率很高，育性较低，可能对果实生产或育种造成问题，特别是在育种者不了解其倍性的情况下[23-24]。对梨种质资源进行倍性鉴定是梨种质资源评价的基础工作之一，本研究对保存在国家果树种质兴城梨、苹果圃的梨种质资源进行倍性鉴定，发掘出多份梨多倍体种质资源，补充和完善了梨种质资源数据库，可为梨育种工作者提供育种指导。