牛源致病性肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定※

●李 彬 彭树德 白和平 史秋梅

（1.秦皇岛抚宁区农业农村局 河北 秦皇岛 066004；2.唐山市食品药品综合检验检测中心 河北 唐山 063000；3.河北科技师范学院 河北 秦皇岛 066004；4.唐河县和杰农业专业合作社 河南 南阳 473000）

肺炎克雷伯氏菌为革兰氏阴性、需氧、无动力杆菌，是一种条件性致病菌，归属于肠杆菌科克雷伯氏菌属[1]，广泛存在于自然界中，也是引起医源性感染的最主要致病菌。1822年，研究人员首次从大叶性肺炎病人痰液里分离出肺炎克雷伯氏菌[2]，之后在全世界范围内相继被报道，近年来陆续报道出该菌引起不同动物源性疾病，据报道已在兔、大熊猫、貉、貂、鹿、鸡、猪、犬、牛、羊[3-4]等物体内分离出致病性肺炎克雷伯氏菌，主要症状为出血性肺炎、菌血症、肠炎、脑膜炎、泌尿道炎症，严重者导致死亡。研究表明该菌对环境适应性和不利条件抵抗力强，还具有多重抗生素抗性和耐药机制，不仅危害养殖业的健康发展还造成了严重的公共卫生问题。2021年11月河北秦皇岛某荷斯坦奶牛养殖养殖场出现母牛化脓性乳房炎及犊牛呼吸道症状，为查明此次牛只发病原因，本研究采集化脓性乳汁与犊牛鼻腔分泌物，进行病原菌的分离鉴定、革兰氏染色、生化鉴定，并通过致病性试验明确牛只发病原因，为该病的预防和治疗提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 样品来源及试验动物

样品为河北秦皇岛荷斯坦奶牛养殖养送检的化脓性乳汁与患呼吸道疾病牛的鼻拭子；试验动物为北京维利通化动物实验中心的6～8周龄BALB/c普通级健康小鼠。

1.2 主要试剂及仪器

LB培养基、绵羊血琼脂培养基，均购自北京陆桥；PCR试剂均购自天根公司；ID32E生化鉴定试纸条、ABI微生物全自动生化鉴定仪，购自法国梅里埃生物公司；细菌DNA提取试剂盒，购自康为世纪生物科技有限公司；革兰氏染色试剂、麦康凯肌醇阿冬醇氨苄青霉素钠琼脂，购自青岛海博生物技术有限公司。

1.3 引物设计与合成

肺炎克雷伯氏菌引物序列：5'-ATGAAACGACCTGATTGCAT-TCGC-3'和5'-TTACTTTT TCCGCGGCTTACCGTC-3'，由上海生工生物科技有限公司合成[5]。

1.4 细菌的分离纯化及革兰氏染色

无菌操作取化脓性乳汁100 μL并加入900 μL灭菌PBS均匀稀释备用；将鼻拭子放入装有3 mL灭菌PBS的EP管中，充分旋转挤压后弃掉棉拭子，分别取一管稀释后的奶液和菌悬液划线于LB琼脂培养基，37℃培养24 h后挑取优势菌纯化至形态单一，再将纯化后单菌落划线于麦康凯肌醇阿冬醇氨苄青霉素钠培养基，观察分离菌的生长特性。最后取纯化后的细菌培养物进行革兰氏染色，染色完成后在油镜下观察染色结果，并拍照记录。

1.5 细菌的生化鉴定

使用ID32E肠杆菌科生化鉴定试纸条鉴定分离菌的生化特性，挑取适量纯化的细菌培养物，使用0.9%的生理盐水调整菌液浓度为0.5麦氏比浊度（约1×108CFU/mL），然后在每个检测孔滴加70 μL菌悬液，0～6孔滴加1滴灭菌甘油（创造厌氧条件）引起吲哚实验，放置在湿盒内，37℃培养箱培养24 h后使用ABI微生物全自动生化鉴定仪读取结果。

1.6 PCR鉴定及序列分析

按照细菌DNA提取试剂盒提取分离菌DNA作为PCR模板，以16S rRNA通用引物扩增分离菌16S rRNA基因，反应体系为20 μL，其中2×TaqPCRMasterMix10 μL，上游引物、下游引物、细菌基因组DNA各1 μL，超纯水补足充至20 μL，PCR结束后取扩增产物5 μL，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，条带符合预期即判断为阳性，并将阳性扩增产物送上海生工生物工程技术服务有限公司纯化、测序，其测序结果在NCBI网站做BLAST比对，并建立系统发育进化树分析种属关系。

1.7 致病性试验

取10只普通级健康BALB/c小鼠，分为攻毒组和对照组，每组各5只，攻毒组处理为向5只小鼠腹腔内注射菌液浓度为1.0×108CFU/mL的细菌悬液0.2 mL，对照组处理为向5只小鼠腹腔内注射0.2 mL灭菌PBS，试验期间小鼠可自由采食和饮水，每天记录小鼠的状况，对死亡的小鼠要及时进行剖检。

2 结果与分析

2.1 临床诊断结果

6周岁左右荷斯坦奶牛临床症状表现为体温40.5℃、拒绝哺乳、乳房红肿、乳头有伤口，乳汁为淡黄色絮状并伴有血丝。30日龄犊牛具有体温升高、精神沉郁、食欲减退、伴有轻微的咳嗽等症状，约2 d后呼吸道症状加重，并伴有流鼻涕现象。

2.2 分离菌形态学观察

分离菌在LB琼脂培养基上生长良好，呈边缘光滑、中间凸起、中等大小的乳白色菌落（图1-A）；在麦康凯肌醇阿冬醇氨苄青霉素钠培养基上生长良好，菌落呈粉红色，伴有粉色沉淀环，黏稠且不易挑起，有明显“拉丝”现象（图1-B）；革兰氏染色后，油镜下可看到阴性短小杆菌，两端顿圆，散在或成对存在（图1-C）。

图1 细菌的形态特征

2.3 生化鉴定结果

取经24 h培养的生化鉴定试纸条，在IND孔滴加1滴吲哚试剂，用ABI微生物自动生化鉴定仪读取鉴定结果，鉴定结果，如表1所示，2株菌的生化特性一致且均与肺炎克雷伯氏菌生化特性相符，初步鉴定为肺炎克雷伯氏菌。

表1 生化鉴定结果

2.4 PCR鉴定及序列分析

通过扩增分离菌16S rRNA基因，得到1500 bp左右条带（图2），与目标片段条带大小相符。经16S rRNA测序结果双向拼接后，结果显示2株菌序列相似性为100%，经NCBI网站中BLAST比较同源性，与肺炎克雷伯氏菌同源性达99.93%。选取同源性较高的序列，利用MEGA7.0软件采用NJ法构建系统进化树，分离菌与肺炎克雷伯氏菌自然聚为一支，与鲍曼不动杆菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌不在同一分支（图3）。以上结果综合分析，证实分离菌为肺炎克雷伯氏菌，并命名为kp-1、kp-2。

图2 分离菌16S rRNA鉴定结果

图3 分离菌16S rRNA基因系统进化树构建结果

2.5 致病性试验

小鼠攻毒24 h后，临床表现为行动迟缓、呼吸急促、畏寒扎堆，48 h后攻毒组全部死亡，刨检可见肺脏出血性浸润，取肺组织进行细菌的分离鉴定，从肺脏中分离出与肺炎克雷伯氏菌生化特性、染色特征结果均为一致的分离菌株，经PCR鉴定为阳性；而对照组肺炎克雷伯氏菌检测结果为阴性。以上试验结果证实本次分离的2株肺炎克雷伯菌均有较强致病性。

3 讨论与结论

克雷伯氏菌是一种重要的人畜共患条件性致病菌，长期存在于动物肠道及上呼吸道，在机体免疫力低下或环境条件发生改变时易引起继发性感染。本研究从乳腺炎奶牛的奶样及呼吸道症状牛鼻拭子中分离鉴定到2株优势菌，通过实验室诊断方法鉴定为肺炎克雷伯氏菌，动物性试验结果显示小鼠死亡，说明该分离菌有较强致病性，且死亡小鼠均出现出血性肺炎的症状，能够从病变肺脏中分离到同源性肺炎克雷伯氏菌，证实肺炎克雷伯氏菌是致此次牛只发病的主要病原菌。在对2株菌16s rRNA基因序列进行同源性分析发现两株菌的同源性为100%，且在系统发育进化树中同处一个分支，这提示2株菌可能来自同一祖先。此外2株菌均能在48 h内致死小鼠，可能这与菌株的毒力基因相关，肺炎克雷伯氏菌的致病性主要与毒力基因的表达与调控因子相关，包括荚膜多糖、黏附素、铁摄入能力、脂多糖。但是对于犊牛是否通过食物链感染该菌，需进一步进行相关研究。

综上，本研究从乳腺炎奶牛的奶样及呼吸道症状牛鼻拭子中分离到2株毒力较强的分离株，不仅为肺炎克雷伯氏菌的临床诊治提供一定参考，也为牛源肺炎克雷伯氏菌生物制品研发提供一定基础数据。