柴芍承气汤对脓毒症大鼠胰腺损伤的影响及机制研究

冯萍 ，吴深宝 ，季峰

1.浙江大学国际健康医学研究院，浙江 义乌 322000； 2.义乌市中心医院，浙江 义乌 322000；3.浙江大学医学院附属第一医院，浙江 杭州 310000

脓毒症（sepsis）是机体应对感染失衡导致的可危及生命的全身炎症反应综合征，最终会导致脓毒性休克和多器官功能障碍综合征[1]。华盛顿大学健康指标与评估研究所（IHME）对1990－2017年全球脓毒症的发病率和病死率进行统计分析，结果显示，2017年因脓毒症死亡人数占全球死亡总人数的19.7%[2]。目前脓毒症相关研究主要集中在肺脏、肾脏和肝脏等，但脓毒症相关胰腺损伤同样具有重要意义[3]。且胰腺损伤会进一步通过内分泌失调、炎症及氧化应激反应使病情加剧[4]。因此，减轻胰腺损伤对治疗脓毒症十分重要。

半胱氨酸白三烯（CysLT）主要由嗜酸性粒细胞、肥大细胞、单核细胞和巨噬细胞产生，作为炎症介质广泛存在于机体中[5]。阻断或选择性抑制CysLT对炎症状态（如哮喘、结肠炎及胰腺损伤）具有改善作用[6]。核因子（NF）-κB通路作为调控炎症反应的重要信号通路，能诱导肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-6、IL-1β等炎症因子表达[7]，阻断该通路可减轻相关器官炎症损伤。CysLT受体1（CysLTR1）可通过NF-κB通路诱导炎症细胞趋化和活化，从而促进炎症反应发生发展[8]。

柴芍承气汤是在大承气汤基础上加柴胡、黄芩、白芍组成。有研究表明，针对胰腺的缺血坏死，柴芍承气汤能抑制胰蛋白酶分泌及活性，改善胰腺微循环并修复微血管内皮损伤，抑制炎症因子释放，从而改善相关症状[9-10]。但柴芍承气汤改善脓毒症继发胰腺损伤的具体机制尚不清楚。本研究通过建立脓毒症继发胰腺损伤大鼠模型，检测胰腺组织CysLTR1和NF-κB表达，探讨柴芍承气汤对脓毒症胰腺损伤的保护作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物

雄性Wistar大鼠36只，体质量（320±30）g，购于浙江中医药大学动物实验研究中心，动物许可证号SYXK（浙）2021-0012。饲养于温度23～25 ℃、湿度55%～65% SPF动物房，自由进食饮水。本实验经浙江大学医学院附属第一医院伦理委员会审批（20221101）。

1.2 药物及制备

柴芍承气汤由白芍10 g、柴胡10 g、黄芩10 g、枳实10 g、厚朴10 g、生大黄10 g、玄明粉10 g组成，将前5味药物饮片置于容器中，加入纯净水煮沸18 min，关火后加入生大黄浸泡2 min，过滤，在滤液中加入玄明粉，冷却至室温。汤剂由义乌市中心医院中医科制备。

1.3 主要试剂及仪器

脂质过氧化物（LPO）试剂盒，南京建成，货号A106-1；谷胱甘肽（GSH）试剂盒，南京建成，货号A006-1；髓过氧化物酶（MPO）试剂盒，南京建成，货号A044；RIPA组织细胞快速裂解液，北京索莱宝，货号R0010；BCA蛋白定量试剂盒，美国Thermo，货号PICPI23223； NC 膜， 美 国Millipore， 货 号HATF00010；CysLTR1 抗体，上海碧云天，货号Orb182861；NF-κB 抗体，美国CST，货号#8242；TUNEL试剂盒，瑞士Roche公司，货号11684817910；DAB 浓缩型试剂盒，上海长岛生物，货号FL-6001；免疫组化试剂盒，福州迈新生物，货号KIT-5002；广谱二抗，上海长岛生物，货号D-3004；蛋白预染Marker，Fermentas，货号SM1811；HRP 标记二抗，上海碧云天，货号分别为A0208、A0181、A0216。

电泳仪（Bio-Rad公司，型号mini protean 3 cell），电转仪（大连竞迈科技有限公司，型号PS-9），酶标仪（芬兰雷勃酶标仪，型号MK3），正置显微镜（日本OLYMPUS公司，型号CX41）。

1.4 分组、造模及给药

36只大鼠采用随机数字表法分为对照组、脓毒症组和柴芍承气汤组，每组12只。脓毒症组和柴芍承气汤组行盲肠结扎穿孔法建立脓毒症模型[11]：术前大鼠禁食不禁水12 h，异氟烷吸入麻醉，于腹部行正中切口，暴露盲肠并结扎其根部，用16号针对盲肠穿刺3次形成肠瘘，并留置2 cm×2 mm橡皮条引流。将盲肠回纳，逐层缝合腹部切口，皮下注射生理盐水50 mL/kg抗休克。手术完毕放回鼠笼饲养观察，自由进食饮水，手术全程遵循无菌原则。对照组仅行开关腹操作。柴芍承气汤组于造模前1 h及造模后6 h各灌胃1次，灌胃体积5 mL/100 g，脓毒症组和对照组灌胃等体积无菌生理盐水。造模后6 h脱颈处死大鼠，造模及灌胃过程中各组均无大鼠死亡。

1.5 生化检测

取相同质量胰腺组织，加入9 倍体积生理盐水，4 ℃匀浆，3 500 r/min离心10 min，取上清液，按试剂盒说明书操作分别检测MPO、LPO、GSH水平。

1.6 免疫组化检测

取胰腺组织（约1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm），经固定、包埋及切片后，进行抗原修复，滴加CysLTR1 一抗（1∶300）、NF-κB一抗（1∶1 000），4 ℃湿盒孵育过夜，滴加HRP标记二抗孵育，DAB显色，封片。在100倍显微镜下，每个样本随机选取8～10个视野，使用Image Pro Plus软件计算平均光密度。

1.7 Western blot检测

胰腺组织加入含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的裂解液，按照20 mg组织加入150～260 μL裂解液比例进行匀浆，4 ℃、12 000×g离心15 min，取上清液，BCA法进行蛋白定量。蛋白上样后，电泳分离蛋白，转至NC 膜，将膜用5%脱脂奶粉封闭1 h，加入CysLTR1 一抗（1∶300）、NF-κB 一抗（1∶1 000）、GAPDH一抗（1∶1 500），4 ℃孵育过夜，TBST洗膜，按1∶1 000加入HRP标记二抗，37 ℃孵育1 h，TBST洗涤，发光液显色处理，凝胶成像系统扫描后，应用Quantity One软件进行灰度值分析，计算目标蛋白灰度值/内参蛋白灰度值，即蛋白相对表达量。

1.8 TUNEL染色

胰腺组织切片加入TUNEL反应液50 μL，37 ℃反应1 h，洗涤后滴加POD液50 μL，37 ℃反应30 min，DAB染色，显微镜下观察，以棕褐色为阳性表达，计算细胞凋亡率（凋亡细胞数÷总细胞数×100%）。

1.9 相关性分析

将对照组及脓毒症组大鼠进行整体分析，以脓毒症组与对照组CysLTR1差值为横坐标，NF-κB差值为纵坐标，采用双变量线性回归分析法求得回归方程，计算相关系数（r）。

1.10 统计学方法

采用SPSS21.0 统计软件进行分析。计量资料用Shapiro-Wilk法行正态性检验，符合正态分布用±s表示，多组间比较用方差分析，组间两两比较用LSD-t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 柴芍承气汤对模型大鼠胰腺组织髓过氧化物酶、脂质过氧化物、谷胱甘肽水平的影响

与对照组比较，脓毒症组胰腺组织MPO、LPO水平显著升高，GSH 水平显著降低（P＜0.001）；柴芍承气汤组胰腺组织MPO、LPO水平显著降低，GSH水平显著升高（P＜0.05，P＜0.01）。见表1。

表1 各组大鼠胰腺组织MPO、LPO、GSH水平比较（±s）

表1 各组大鼠胰腺组织MPO、LPO、GSH水平比较（±s）

注：与对照组比较，***P＜0.001；与脓毒症组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

GSH/（mg/g）5.53±0.38 1.68±0.37***2.90±0.37#组别对照组脓毒症组柴芍承气汤组只数12 12 12 MPO/（U/g）1.07±0.16 3.68±0.44***2.66±0.19#LPO/（μmoL/g）0.60±0.08 1.97±0.17***1.49±0.10##

2.2 柴芍承气汤对模型大鼠胰腺组织半胱氨酸白三烯受体1、核因子-κB表达的影响

免疫组化结果显示，与对照组比较，脓毒症组大鼠胰腺组织CysLTR1、NF-κB 表达显著升高（P＜0.001，P＜0.01）；与脓毒症组比较，柴芍承气汤组大鼠胰腺组织CysLTR1、NF-κB表达显著降低（P＜0.05）。见图1、表2。

图1 各组大鼠胰腺组织CysLTR1、NF-κB阳性表达（免疫组化染色，×200）

表2 各组大鼠胰腺组织CysLTR1、NF-κB表达比较（±s，平均光密度）

表2 各组大鼠胰腺组织CysLTR1、NF-κB表达比较（±s，平均光密度）

注：与对照组比较，**P＜0.01，***P＜0.001；与脓毒症组比较，#P＜0.05

NF-κB 328.00±96.63 603.33±50.64**512.33±16.65#组别对照组脓毒症组柴芍承气汤组只数12 12 12 CysLTR1 594.67±124.31 1 164.00± 94.60***859.00± 41.39#

Western blot结果显示，与对照组比较，脓毒症组大鼠胰腺组织CysLTR1、NF-κB 蛋白表达显著升高（P＜0.001）；与脓毒症组比较，柴芍承气汤组大鼠胰腺组织CysLTR1、NF-κB蛋白表达显著降低（P＜0.001）。见图2、表3。

图2 各组大鼠胰腺组织CysLTR1、NF-κB蛋白免疫印迹

表3 各组大鼠胰腺组织CysLTR1、NF-κB蛋白表达比较（±s）

表3 各组大鼠胰腺组织CysLTR1、NF-κB蛋白表达比较（±s）

注：与对照组比较，***P＜0.001；与脓毒症组比较，###P＜0.001

NF-κB 0.121 6±0.008 2 0.572 4±0.026 8***0.361 7±0.010 8###组别对照组脓毒症组柴芍承气汤组只数12 12 12 CysLTR1 0.082 5±0.001 4 0.545 6±0.010 5***0.382 7±0.030 3###

2.3 柴芍承气汤对模型大鼠胰腺组织细胞凋亡的影响

与对照组比较，脓毒症组大鼠胰腺组织细胞凋亡率显著升高（P＜0.001）；与脓毒症组比较，柴芍承气汤组大鼠胰腺组织细胞凋亡率显著降低（P＜0.01）。见图3、表4。

图3 各组大鼠胰腺组织细胞凋亡阳性表达（TUNEL染色，×200）

表4 各组大鼠胰腺组织CysLTR1、NF-κB凋亡率比较（±s，%）

表4 各组大鼠胰腺组织CysLTR1、NF-κB凋亡率比较（±s，%）

注：与对照组比较，***P＜0.001；与脓毒症组比较，##P＜0.01

凋亡率33.31±6.19 65.08±5.39***43.83±4.88##组别对照组脓毒症组柴芍承气汤组只数12 12 12

2.4 相关性分析结果

对免疫组化和Western blot 检测的脓毒症组与对照组CysLTR1、NF-κB差值进行相关性分析。结果显示，NF-κB 表达与CysLTR1 表达呈显著正相关（P＜0.05，P＜0.01），2种检测方法r分别为0.732 0和0.642 4。见表5。

表5 2种检测方法的胰腺组织CysLTR1、NF-κB表达相关性分析

3 讨论

脓毒症是宿主对感染反应失调导致的全身炎症反应综合征，中心环节是失控性的炎症反应，最终导致多器官功能衰竭和脓毒性休克，是重症感染死亡的主要原因[12]。胰腺损伤是脓毒症重要的器官功能障碍之一，脓毒症引起的胰腺损害是由多因素、多条件介导的病理过程，可能涉及由细菌移位引起的内毒素血症、脏器及血管缺血再灌注损伤、血栓形成和代谢及免疫功能抑制等多方面[13-14]。本研究发现，脓毒症大鼠胰腺组织细胞凋亡率显著升高，表明在脓毒症中存在胰腺组织细胞水平的损伤。研究显示，危重患者如果在原发疾病基础上出现胰酶水平升高，可使病情进一步恶化甚至导致死亡[15-16]。因此，对胰腺组织损伤机制的研究需要进一步深入。本研究也发现，脓毒症损伤的胰腺组织中，反映炎症程度的MPO和LPO水平上调，具有抗炎、抗氧化作用的GSH水平下调，提示脓毒症引起的组织损伤是失调性炎症反应。

CysLT是由花生四烯酸经5-脂氧酶催化而生成的一类活性很强的炎症介质，是过敏性慢反应物质，具有强烈促炎作用，通过细胞表面受体CysLTR1 和CysLTR2 发挥作用[17]。CysLT 可以提高血管通透性，引起炎症细胞趋化及浸润，并引起相关炎症因子释放，诱导细胞发生氧化应激反应。不仅参与过敏性鼻炎、支气管哮喘等发病过程，对缺血引起的脑细胞损伤同样起到重要作用[18]。研究表明，CysLTR的特异性阻滞剂孟鲁司特钠能提高GSH水平，减轻脂质过氧化，抑制炎症级联反应，从而对脓毒症引起的胰腺、小肠、肝脏损伤产生保护作用[19]。本研究脓毒症组大鼠胰腺组织CysLTR1蛋白表达较对照组显著升高，说明脓毒症引起的胰腺损伤可能由CysLTR1介导。

NF-κB作为真核细胞的核转录因子，在正常细胞质中为无活性物质。当炎症介质或内毒素等刺激后，NF-κB活化并转移至细胞核内，与炎症相关物质特定的基因序列结合并转录，从而引起炎症反应[20]。研究发现，CysLT可引起NF-κB活性增强，促进靶基因转录，从而引起炎症介质释放增加[8]；Wang等[21]研究表明，激活CysLTR1介导的NF-κB信号通路可诱导神经炎症，引起神经损伤。提示NF-κB作为CysLTR下游通路，受CysLTR1调控。本研究发现，CysLTR1与NF-κB表达呈正相关，在一定程度上表明CysLTR1 可介导NF-κB通路活化。NF-κB通路也参与由脓毒症引起的组织器官损害：Shang等[22]研究发现，白藜芦醇可通过抑制NF-κB通路减轻脓毒症诱导的心肌损伤；El-Tanbouly等[23]也发现，NF-κB抑制剂雷公藤红素可减轻因盲肠结扎和穿刺诱导的大鼠急性肝功能障碍。本研究脓毒症组大鼠胰腺组织NF-κB表达显著升高，提示脓毒症引起的胰腺损伤可能存在NF-κB信号通路活化。

脓毒症基本病机在于正虚毒损和络脉瘀滞，根本为正气不足、毒邪内蕴，并在此基础上进一步发展成机体阳脱阴竭、气阴两虚。柴芍承气汤是治疗脓毒症胰腺损伤的重要方剂，具有通里攻下、峻下热结作用。研究显示，大黄有效成分能有效抑制胰酶分泌和肠道细菌内毒素滋生[24]；柴胡中柴胡皂苷具有抑制胰蛋白酶、抗炎、调节免疫及解热镇痛作用[25]；白芍中白芍总苷可通过抑制NF-κB信号通路抑制炎症反应，减少胰腺细胞凋亡[26]；厚朴可通过阻断NF-κB信号通路减少TNF-α和IL-6释放，从而减轻炎症反应[27]。本研究中脓毒症大鼠经柴芍承气汤干预后，胰腺组织细胞凋亡显著减少，MPO、LPO水平显著降低，GSH水平升高，表明柴芍承气汤对胰腺损伤具有一定保护作用。进一步研究发现，柴芍承气汤可显著降低胰腺组织CysLTR1、NF-κB表达，推测柴芍承气汤可能通过抑制CysLTsR1/NF-κB通路从而减轻脓毒症胰腺损伤。本研究可为临床治疗脓毒症胰腺损伤提供新思路。