牛蒡子苷元抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路减轻单侧输尿管梗阻大鼠肾纤维化

高海洋， 陈曦， 张金存， 关晓海， 曹凤宏， 康绍叁， 王磊， 么安亮， 刘健， 张立国

（华北理工大学附属医院泌尿外科，河北唐山 063000）

肾纤维化是几乎所有慢性和进行性肾病常见的病理改变[1]。在慢性肾病中，纤维化是一种主动的生物合成愈合反应，其目的是保护组织免受损伤。然而，当纤维化独立于初始刺激时，它会导致严重的器官损伤[2]。大量研究表明，天然产物用于预防和治疗纤维化具有广阔的前景。肾纤维化归属于中医学“水肿”“癃闭”“虚劳”“肾劳”“肾风”“溺毒”“尿浊”等范畴，其病机多由脾肾虚衰，湿浊羁留，浊邪壅塞三焦，气机升降失调，导致水湿、湿热、痰浊、浊毒和瘀血等病理产物集聚所致，补益脾肾、清热利湿、化浊排毒、活血化瘀为主要治法[3]。牛蒡子，味辛、苦，性寒，具有疏散风热、宣肺透疹、解毒利咽的功效[4]。已有研究表明，牛蒡子可用于治疗糖尿病肾脏病[5]。牛蒡子苷元（arctigenin）是从牛蒡中分离出的木脂素衍生化合物，现代药理学研究表明，其具有抗病毒、抗炎、抗肾损伤的作用[6-10]。既往有研究表明，牛蒡子苷元可通过抑制炎症、氧化应激来保护肾脏免受单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）诱导的损伤和纤维化[11]。减弱源自高迁移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）/Toll 样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路传导的纤维化信号可预防UUO 诱导的肾纤维化[12]。但牛蒡子苷元能否通过调控HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路减轻UUO大鼠肾纤维化尚未见报道。因此，本研究通过构建UUO 大鼠模型，探讨牛蒡子苷元对UUO 大鼠肾纤维化的治疗作用及机制，旨在为肾纤维化的临床治疗提供新的思路，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物60 只SPF 级雄性SD 大鼠，8～10 周龄，体质量308 ～317 g，购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，动物生产许可证号为SCXK（吉）2019-0007，于华北理工大学附属医院动物实验室进行实验，动物使用许可证号为SYXK（冀）2021-0014。大鼠饲喂标准饲料，饲养条件为温度（23±2）℃，平均湿度（55±5）%，自由进食和饮水。本研究动物实验方案已经华北理工大学附属医院伦理委员会批准，批准编号：DWLS2021 第107 号。

1.2 主要药物、试剂与仪器牛蒡子苷元（分子量：372.412，分子式：C21H24O6，分子结构纯度≥98%，批号：HEJCX-00001978-025），购自合肥博美生物科技有限责任公司。将牛蒡子苷元溶于生理盐水配制成1.0、2.0 mg/mL（0.002 7、0.005 4 mol/L）的牛蒡子苷元溶液。HMGB1过表达质粒购自武汉华联科生物公司；白细胞介素（IL）-1β、IL-6酶联免疫吸附分析（ELISA）试剂盒，末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）细胞凋亡检测试剂盒，均购自武汉亚科因生物公司；兔源α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Ⅰ型胶原蛋白（Collagen Ⅰ）、HMGB1、TLR4、磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）、NF-κB p65、β-actin 等一抗、羊抗兔IgG 二抗，均购自美国Abcam 公司。全自动生化分析仪（型号：Senlo8011）、显微镜（型号：NE950）、酶标仪（型号：PT-3502B），均购自成都斯马特科技有限公司；蛋白成像仪（型号：BOT-860SR），购自北京诺汇诚科技有限公司。

1.3 分组、建模与给药将60 只SD 大鼠随机分为假手术组、模型组、牛蒡子苷元低剂量组、牛蒡子苷元高剂量组、HMGB1 过表达质粒+牛蒡子苷元高剂量组（HMGB1+牛蒡子苷元高剂量组），每组12 只。除假手术组外，其余各组大鼠参照文献研究[13]进行UUO 模型的构建。造模方法：采用腹腔注射3%戊巴比妥钠（90 mg/kg）麻醉大鼠，切开大鼠左腹侧表面，分离左侧输尿管并用丝线于上1/3 处双结扎，使左肾处于完全梗阻的状态，最后缝合伤口。假手术组大鼠仅分离左侧输尿管，不进行结扎处理。术后第2天开始给药，给药剂量参照文献研究[14]及前期预实验结果进行确定。牛蒡子苷元低剂量组按照10 mg/kg的剂量灌胃牛蒡子苷元（10 mL/kg，0.002 7 mol/L），同时尾静脉注射等体积生理盐水；牛蒡子苷元高剂量组按照20 mg/kg的剂量灌胃牛蒡子苷元（10 mL/kg，0.005 4 mol/L），同时尾静脉注射等体积生理盐水；HMGB1+牛蒡子苷元高剂量组灌胃20 mg/kg的牛蒡子苷元外，同时尾静脉注射8 μg/kg HMGB1 过表达质粒[15]；假手术组、模型组灌胃并尾静脉注射等体积生理盐水。每日1次，持续14 d。

1.4 标本收集末次给药结束后，代谢笼收集大鼠24 h尿液用于24 h尿蛋白定量（UTP）的检测。麻醉后经心脏穿刺取血，离心得血清用于血肌酐（SCr）、血尿素氮（BUN）的检测。心脏穿刺取血后处死大鼠，收集大鼠左侧肾组织，分为两部分，一部分固定于4%多聚甲醛中，另一部分冻存于液氮中。

1.5 观察指标与方法

1.5.1 肾功能指标的检测 应用全自动生化分析仪检测24 h UTP 及SCr、BUN 水平。

1.5.2 肾组织的苏木素-伊红（HE）染色及Masson染色 将固定于4%多聚甲醛的肾组织以石蜡包埋，切成4 μm 厚的切片，通过HE 染色法检测肾组织病理变化，Masson 染色法检测大鼠肾组织纤维化程度，均置于显微镜下观察。

1.5.3 ELISA 法检测肾组织中IL-1 β、IL-6水平 将液氮中冻存的肾组织解冻匀浆，严格按照IL-1β、IL-6 试剂盒说明书检测肾组织匀浆中IL-1β、IL-6水平。

1.5.4 TUNEL 染色法检测肾细胞凋亡 取肾组织石腊切片，应用TUNEL 试剂盒染色检测肾细胞凋亡。TUNEL 染色阳性的细胞呈绿色荧光，细胞核呈蓝色。细胞凋亡率（%）=（绿色荧光细胞数/细胞总数）×100%。

1.5.5 蛋白印迹法检测肾组织中蛋白表达 用放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解缓冲液提取肾组织匀浆中的总蛋白，将40 μg 蛋白质样品进行电泳、转膜、封闭，再将膜与按体积比稀释的一抗包括α-SMA（1∶1 700）、Collagen I（1∶1 700）、HMGB1（1∶1 300）、TLR4（1∶1 450）、p-NF-κB p65（1∶1 350）、NF-κB p65（1∶1 350）、β-actin（1∶1 000）于4 ℃孵育过夜，然后与羊抗兔IgG 二抗（1∶2 700）37 ℃温育1 h，加入增强化学发光（ECL）底物染色5 min，曝光显影，最后使用ImageJ 软件对蛋白灰度值进行定量。

1.6 统计方法采用SPSS 25.0软件处理数据，计量资料（均符合正态分布）以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较行SNK-q检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 牛蒡子苷元对UUO模型大鼠肾功能的影响表1 结果显示：与假手术组比较，模型组大鼠24 h UTP、SCr、BUN 水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，牛蒡子苷元低、高剂量组大鼠24 h UTP、SCr、BUN水平降低（P＜0.05）；与牛蒡子苷元低剂量组比较，牛蒡子苷元高剂量组大鼠24 h UTP、SCr、BUN水平降低（P＜0.05）；与牛蒡子苷元高剂量组比较，HMGB1+牛蒡子苷元高剂量组大鼠24 h UTP、SCr、BUN水平升高（P＜0.05）。

表1 各组大鼠肾功能比较Table 1 Comparison of renal function among each group of rats（±s）

注：①P＜0.05，与假手术组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与牛蒡子苷元低剂量组比较；④P＜0.05，与牛蒡子苷元高剂量组比较

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2.2 牛蒡子苷元对UUO模型大鼠肾组织病理变化及纤维化的影响HE 染色结果显示：与假手术组比较，模型组可见肾小球基底膜增厚、系膜增生，且有大量炎性细胞浸润；与模型组比较，牛蒡子苷元低、高剂量组大鼠肾组织病理损伤减轻；与牛蒡子苷元高剂量组比较，HMGB1+牛蒡子苷元高剂量组大鼠肾组织病理损伤加剧。见图1。

图1 各组大鼠肾组织病理变化比较（HE染色法，×200）Figure 1 Comparison of histopathological changes among each group of rats（HE staining，×200）

Masson 染色结果显示：与假手术组比较，模型组大鼠的肾组织中可见大量蓝染区域，纤维化严重；与模型组比较，牛蒡子苷元低、高剂量组肾组织蓝染区域减少，纤维化减轻；与牛蒡子苷元高剂量组比较，HMGB1+牛蒡子苷元高剂量组肾组织纤维化加剧。见图2。

图2 各组大鼠肾组织纤维化表现比较（Masson染色法，×200）Figure 2 Comparison of fibrosis manifestations of renal tissue among each group of rats（Masson，×200）

2.3 牛蒡子苷元对UUO模型大鼠肾组织中IL-1β、IL-6水平的影响表2 结果显示：与假手术组比较，模型组IL-1β、IL-6 水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，牛蒡子苷元低、高剂量组IL-1β、IL-6 水平降低（P＜0.05）；与牛蒡子苷元低剂量组比较，牛蒡子苷元高剂量组IL-1β、IL-6水平降低（P＜0.05）；与牛蒡子苷元高剂量组比较，HMGB1+牛蒡子苷元高剂量组IL-1β、IL-6水平升高（P＜0.05）。

表2 各组大鼠肾组织中IL-1β、IL-6水平比较Table 2 Comparison of IL-1β and IL-6 levels in renal tissue among each group of rats（±s，pg·mL-1）

表2 各组大鼠肾组织中IL-1β、IL-6水平比较Table 2 Comparison of IL-1β and IL-6 levels in renal tissue among each group of rats（±s，pg·mL-1）

注：①P＜0.05，与假手术组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与牛蒡子苷元低剂量组比较；④P＜0.05，与牛蒡子苷元高剂量组比较

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2.4 牛蒡子苷元对UUO模型大鼠肾细胞凋亡的影响图3、表3 结果显示：与假手术组比较，模型组肾细胞凋亡率升高（P＜0.05）；与模型组比较，牛蒡子苷元低、高剂量组肾细胞凋亡率降低（P＜0.05）；与牛蒡子苷元低剂量组比较，牛蒡子苷元高剂量组肾细胞凋亡率降低（P＜0.05）；与牛蒡子苷元高剂量组比较，HMGB1+牛蒡子苷元高剂量组肾细胞凋亡率升高（P＜0.05）。

图3 各组大鼠肾细胞凋亡比较（TUNEL染色，×200）Figure 3 Comparison of renal cell apoptosis among each group of rats（TUNEL staining，×200）

表3 各组大鼠肾细胞凋亡率比较Table 3 Comparison of renal cell apoptosis rate among each group of rats（±s，%）

表3 各组大鼠肾细胞凋亡率比较Table 3 Comparison of renal cell apoptosis rate among each group of rats（±s，%）

注：①P＜0.05，与假手术组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与牛蒡子苷元低剂量组比较；④P＜0.05，与牛蒡子苷元高剂量组比较

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2.5 牛蒡子苷元对UUO模型大鼠肾组织中纤维化相关蛋白α-SMA、CollagenⅠ表达的影响图4、表4 结果显示：与假手术组比较，模型组α-SMA、CollagenⅠ蛋白表达升高（P＜0.05）；与模型组比较，牛蒡子苷元低、高剂量组α-SMA、CollagenⅠ蛋白表达降低（P＜0.05）；与牛蒡子苷元低剂量组比较，牛蒡子苷元高剂量组α-SMA、CollagenⅠ蛋白表达降低（P＜0.05）；与牛蒡子苷元高剂量组比较，HMGB1+牛蒡子苷元高剂量组α-SMA、CollagenⅠ蛋白表达升高（P＜0.05）。

图4 各组大鼠肾组织α-SMA、Collagen I蛋白电泳条带图（Western Blot法）Figure 4 Comparison of electrophoretic bands of α-SMA and Collagen I in renal tissue among each group of rats（Western Blot method）

2.6 牛蒡子苷元对UUO模型大鼠肾组织中HMGB1/TLR4/NF-κB通路蛋白表达的影响图5、表5 结果显示：与假手术组比较，模型组HMGB1、TLR4、p-NF-κB p65 蛋白相对表达量升高（P＜0.05）；与模型组比较，牛蒡子苷元低、高剂量组HMGB1、TLR4、p-NF-κB p65 蛋白相对表达量降低（P＜0.05）；与牛蒡子苷元低剂量组比较，牛蒡子苷元高剂量组HMGB1、TLR4、p-NF-κB p65 蛋白相对表达量降低（P＜0.05）；与牛蒡子苷元高剂量组比较，HMGB1+牛蒡子苷元高剂量组HMGB1、TLR4、p-NF-κB p65 蛋白相对表达量升高（P＜0.05）。

图5 各组大鼠肾组织HMGB1/TLR4/NF-κB通路相关蛋白电泳条带图（Western Blot法）Figure 5 Comparison of electrophoretic bands of HMGB1/TLR4/NF-κB pathway-related proteins in renal tissue among each group of rats（Western Blot method）

3 讨论

肾纤维化作为慢性肾病的一个关键步骤，其主要特征包括促纤维化因子的过度产生和沉积、肾小管间质炎症反应、肾细胞大量凋亡等[16-18]。相关研究显示，单侧输卵管梗阻（UUO）小鼠肾功能指标SCr、BUN水平以及血清中炎症因子IL-1β、IL-6 水平升高，表明UUO 小鼠存在肾功能下降及炎症反应[19]；在UUO 后，包括Collagen I、α-SMA在内的多种纤维化蛋白在肾组织中的表达显著增加，提示UUO 成功诱导了肾纤维化[20]；肾细胞凋亡加速了肾纤维化的进展[21]。UUO是一种经典且广泛使用的实验性肾间质纤维化模型[22]。本研究构建了UUO 大鼠模型，HE 及Masson 染色结果显示，模型组大鼠肾组织病理损伤及纤维化严重，且CollagenⅠ、α-SMA 的表达升高，表明UUO 诱导肾纤维化大鼠模型构建成功。本研究结果还显示，模型组大鼠肾功能指标（24 h UTP、SCr、BUN）、炎性因子（IL-1β、IL-6）水平及肾细胞凋亡率显著高于假手术组，提示UUO 诱导肾纤维化大鼠肾功能异常，炎症反应及肾细胞凋亡加剧。经低、高剂量牛蒡子苷元处理后，UUO 大鼠肾组织病理损伤减轻，纤维化减少，24 h UTP、SCr、BUN、IL-1β、IL-6 水平及肾细胞凋亡率明显降低，提示牛蒡子苷元可抑制UUO 大鼠肾纤维化及炎症损伤。

HMGB1 是炎症反应重要的调节剂，其可与TLR4 结合，通过髓样分化因子88（MyD88）依赖性机制激活NF-κB 信号通路，进而促进炎症细胞因子的产生，如IL-1β 和IL-6 等[23]。据报道：抑制HMGB1/TLR4/NF-κB 信号通路可对造影剂肾病产生肾脏保护作用[24]；抑制HMGB1/TLR4/NF-κB 通路可减轻糖尿病肾病大鼠肾组织病理损伤[25]；Lu等[26]研究表明，牛蒡子苷元能抑制HMGB1/TLR4/NF-κB 信号通路，改善弓形虫诱导的肝损伤小鼠肝脏炎症。因此，本研究推测牛蒡子苷元可能通过抑制HMGB1/TLR4/NF-κB 信号通路介导的炎症反应在肾纤维化中起到一定的治疗作用。本研究结果显示，UUO 大鼠肾组织中HMGB1、TLR4、p-NF-κB p65 蛋白表达升高，推测HMGB1/TLR4/NF-κB 信号通路参与了UUO 大鼠肾纤维化进程。牛蒡子苷元干预后，UUO 大鼠肾组织中HMGB1/TLR4/NF-κB 信号通路上述蛋白表达明显减少，推测牛蒡子苷元通过抑制HMGB1/TLR4/NF-κB 信号通路减轻UUO 大鼠肾纤维化。为了验证该推测结果，本研究将高剂量牛蒡子苷元处理的UUO 大鼠再用HMGB1 过表达质粒进行干预，结果显示，HMGB1 逆转了高剂量牛蒡子苷元对UUO 大鼠肾纤维化的抑制作用。

综上所述，牛蒡子苷元对UUO 大鼠肾纤维化具有明显的改善作用，其机制与抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路有关。