三步止泻治疗小儿腹泻调控肠微生态的机制研究

杨丽秋 龙鑫 彭强 杨阳 岳阳 杨永兰 龙毅 杨宇 朱丽

摘要：目的  通過本项目研究，了解三步止泻法治疗腹泻乳兔的可能作用机制，明确三步止泻法治疗小儿腹泻与肠微生态作用机制的强相关性。方法  将乳兔制作脾虚证模型后，分为六组即：补脾组、摩腹组、推上七节骨组、三步止泻手法组、益生菌组、模型组，经过治疗周期后，处死乳兔后，将胃黏膜、肠黏膜组织切片进行HE染色，观察乳兔胃、肠黏膜的组织学变化；检测腹泻兔血浆内毒素的表达水平；并收集各组大鼠粪便排泄物，进行微生物组总DNA提取，目标片段PCR扩增，扩增产物回收纯化，扩增产物荧光定量，测序文库制备，上机进行高通量测序，然后多元化对比，后统计分析。结果  兔胃肠组织HE染色提示治疗后三步止泻手法组、补脾组、摩腹组及推上七节骨组、益生菌组能有效的改善兔胃肠组织水肿及炎症情况；血浆内毒素的表达水平表明补脾组在降低兔血浆内毒素有较好的效果（P<0.05），三步止泻手法组、摩腹组、推上七节骨组及益生菌组对降低兔血浆内毒素也有一定的作用；OTU/ASV分析、Alpha多样性分析表明摩腹组及三步止泻手法组可纠正菌群紊乱，提高菌群的丰富度及均匀性，使肠道内环境恢复稳态。结论  三步止泻手法组具有刺激宿主产生免疫及清除功能、减少内毒素的吸收、调整肠道菌群间及其与人体生理机能的平衡状态，改善腹泻症状，且研究表明，各手法组在治疗中，针对性各有不同。

关键词：三步止泻；小儿推拿；小儿腹泻；肠微生态

中图分类号：R256.34      文献标志码：B      文章编号：1007-2349（2023）06-0070-06

Study on the Mechanism of Three-Step Antidiarrheal Therapy in the Treatment of Infantile Diarrhea by Regulating Intestinal Microecology

YANG Li-qiu， LONG Xin， PENG Qiang， YANG Yang， YUE Yang， YANG Yong-lan， LONG Yi， YANG Yu， ZHU Li

（Yunnan Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650021， China）

【Abstract】Objective： Through this study， to understand the possible mechanism of action of three-step antidiarrheal therapy in the treatment of diarrhea in suckling rabbits， and to clarify the strong correlation between the three-step antidiarrheal therapy in the treatment of diarrhea in children and the intestinal microecological mechanism of action. Methods： After the spleen deficiency syndrome model of the suckling rabbits was made， the rabbits were divided into six groups： spleen tonifying group， abdominal massage group， seven-segment bone pushing group， three-step antidiarrheal technique group， probiotics group and model group. After the treatment cycle and the suckling rabbits were sacrificed， the gastric mucosa and intestinal mucosa tissues were sliced for HE staining， and the histological changes of the gastric mucosa and intestinal mucosa were observed. The expression level of plasma endotoxin of the diarrhea rabbits was detected. The feces and excrement of the rabbits each group were collected for total DNA extraction of microbiome， PCR amplification of target fragments， recycling and purification of amplification products， fluorescence quantification of amplification products， preparation of sequencing library， high-throughput sequencing on the computer， and then diversified comparison， and statistical analysis. Results： The HE staining of the rabbit gastrointestinal tissue suggested that after treatment， the three-step antidiarrhea manipulation group， the spleen tonifying group， the abdominal massage group， the seven-segment bone pushing group and the probiotics group could effectively improve the edema and inflammation of the rabbit gastrointestinal tissue. The expression level of plasma endotoxin showed that the spleen tonifying group had a good effect on the reduction of the rabbit plasma endotoxin （P<0.05）， and the three-step antidiarrhea manipulation group， the abdominal massage group， the seven-segment bone pushing group and the probiotics group also had a certain effect on the reduction of the rabbit plasma endotoxin. OTU/ASV analysis and Alpha diversity analysis showed that the abdominal massage group and the three-step antidiarrhea manipulation group could correct the flora disorder， improve the richness and uniformity of the flora， and restore the intestinal environment to a stable state. Conclusion： The three-step antidiarrheal manipulation group can stimulate the host to produce immunity and clearance function， reduce the absorption of endotoxin， adjust the balance between intestinal flora and human physiological function， and improve the symptoms of diarrhea. The study has shown that each manipulation group has different pertinence in the treatment.

【Key words】Three-Step Antidiarrheal Therapy; Pediatric Massage; Infantile Diarrhea; Intestinal Microecology

小儿腹泻亦称小儿泄泻，是小儿常见的消化系统疾病，发病年龄3岁以下多见，一年四季均可发病，尤以季节更替时明显。它主要表现为大便次数增多并且粪质改变，病情较重者可出现脱水及电解质紊乱或危及生命。三步止泻法是本课题组小儿推拿治疗腹泻的特效推拿疗法，取穴简单，操作简单，无副作用，疗效明确^［1］。本项目从肠微生态作用机制着手，通过对血浆检测内毒素，动物胃肠组织形态学改变，粪便肠道菌群改变来了解三步止泻手法治疗小儿腹泻的可能作用机制，现报道如下。

1  材料与方法

1.1  实验材料

1.1.1  动物取健康的日本大耳乳兔70只，体重3.0～3.5 kg，雌雄各半，重量分布均一。（由云南中医学院实验动物中心提供），动物实验饲养环境：饲养于IVC动物实验室，温度20～25℃（日温差≤3℃）；湿度40%～70%；照明12h：12h明暗交替，照度150～300lx；噪音≤60dB。

1.1.2  实验试剂  HE 染色试剂盒（Solarbio，生产编号：G1121）；ELISA 试剂盒（江苏酶标生物科技有限公司，生产编号：MB-3113A）。

1.2  实验方法

1.2.1  实验分组与造模  将日本大耳乳兔70只随机分为7组，每组10 只分别为空白组、模型组、补脾组、摩腹组、推上七节骨组、三步止泻手法组，益生菌组。

1.2.2  造模方法  采用通过喂服生大黄粉（与饲料拌食）续灌服14 d，每天3次。模型标准为出现腹泻症状，大便性状变为稀便或水样便，次数增多，体重下降，毛色光泽杂乱，神情呆滞，四肢乏力等脾虚的症状。

1.2.3  治疗方法  手法治疗组（40只），专人操作，手法、操作步骤及时间固定。操作方法如下：如三步止泻手法组10只；三步止泻法每天治疗1次，连续治疗1周，其它手法组同前。对照组乳兔予喂服益生菌药物治疗，每天1次，治疗1周；空白组为模型制作后不予任何治疗，予正常饲料喂养观察。模型组继续喂服生大黄粉（与饲料拌食）。

1.2.4  取材和指标检测  （1）组织切片：在无菌的条件下，从动物的肠和胃上取下组织块（厚度不超过0.5厘米）投入预先配好的固定液中（10％福尔马林，Bouin氏固定液等）使组织、细胞的蛋白质变性凝固，通过脱水透明、浸蜡包埋、切片与贴片、脱蜡染色、封固等步骤制作切片标本待观察分析。（2）血浆：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000 转离心10 min将血清和红细胞迅速小心分离。用ELISA法检测血浆内毒素的表达水平。（3）粪便：分别收集空白对照组，模型组，治疗组6组，各组兔治疗7 d后的新鲜粪便保存在印P管中，做好编号和记录，-70℃保存备用。通过粪便样本总DNA提取、目标片段PCR扩增、扩增产物回收纯化、扩增产物荧光定量等方法，分析肠道菌群的多样性及种类。

1.2.5  统计学方法  应用SPSS26.0统计学软件进行统计，计量资料用t检验，计数资料用卡方检验，实验结果中的数值表示以均数±标准差（x±s）表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1  HE观察兔肠组织和胃组织病理改变

2.1.1  HE观察兔肠组织病理改变  正常对照组兔肠组织可见结构清晰完整，表面绒毛排列规则且整齐，隐窝结构清晰，未见炎细胞浸润；模型组可见肠绒毛明显肿胀、紊乱、脱落，黏膜上皮可见大量散在炎细胞浸润，隐窝深度变浅，固有层炎细胞浸润明显，且可见明显疏松、水肿；益生菌组、三步止泻手法组、补脾组、摩腹组及推上七节骨组可见肠绒毛肿胀较模型组减轻，肠绒毛形态较完整，黏膜层少量淋巴细胞浸润，腺体明显增多，水肿减轻，其中摩腹组、推上七骨组、补脾组改善作用稍好于益生菌组及三步止泻手法组。见图1。

2.1.2  HE观察兔胃组织病理改变  正常组兔胃组织可见胃黏膜光滑完整，无腺状结构紊乱或丢失，无出血或黏膜下水肿，模型组可见胃黏膜胃腺结构紊乱、丢失明显，局部可见溃疡灶，大量黏膜下水肿、炎症细胞浸润和散在出血点；益生菌组、三步止泻手法组、补脾组、摩腹组及推上七节骨组可见部分胃腺体紊乱，丢失，但均较模型组减轻，组织间炎细胞数量减少，无明显浸润，出血有所减少，其中摩腹组、推上七骨组、补脾组改善作用稍好于益生菌组及三步止泻手法组。见图2。

2.2  ELISA检测腹泻兔血浆内毒素的表达水平

2.3  腹泻兔肠道微生物多样性结果

2.3.1  稀释性曲线  稀释性曲线（Rarefaction Curve）的速率表示：在一定范围内，随着测序条数的加大，若曲线表现为急剧上升则表示群落中有大量物种被发现；当曲线趋于平缓，则表示此环境中的物种并不会随测序数量的增加而显著增多。稀释曲线可以作为对各样本测序量是否充分的判断，下图说明样品序列充分，可以进行数据分析。结果提示各组中菌群丰富且相对稳定，无新菌群的出现和大量菌群的缺失，而模型组的菌群丰富度较其它组的低。见图 3。

2.3.2  等级丰度曲线  等级丰度曲线主要用于同时解释样品所含物种的丰富度和均匀度，物种的丰富度由曲线在横轴上的长度来反映，曲线越宽，表示物种的组成越豐富；物种组成的均匀度由曲线的形状来反映，曲线越平坦，表示物种组成的均匀程度越高，下图提示肠道菌群物种丰富度较高且均匀分布。见图4

2.3.3  OTU/ASV分析  OTU即分类操作单元，按最样本序列数抽平后 OTU 物种分析显示，测序数据7 组共70个样本，菌群序列长度分布在 839～873bp，使用Usearch软件对Reads在97.0%的相似度水平下进行聚类、获得OTU。通过下面OTU图像得出，与模型组相比，各治疗组的菌群序列长度与正常组接近，说明各种治疗方法，都可以改善腹泻兔的菌群，使腹泻兔的失衡菌群，尽快恢复。其中三步止泻手法组、推下七节骨组、益生菌组在改善菌群失衡方面，效果更明显。见图5。

2.3.4  肠道菌群Alpha多样性分析  Alpha多样性反映的是单个样品物种丰度及物种多样性，Chao1和Ace指数衡量物种丰富度及多样性。模型组ace指数明显降低，摩腹组及三步止泻手法组ace指数较模型组显著升高，其余组较模型组具升高趋势；模型组chao指数降低，摩腹组较模型组chao指数显著升高，三步止泻手法组较模型组具升高趋势。提示在提高腹泻兔肠道菌群的丰富度及多样性方面，摩腹组及三步止泻优势更加明显。见图6。

3  讨论

肠道菌群是按一定的比例组合，各种菌群在质量和数量上形成稳态平衡，个菌群之间相互制约与依赖，肠道菌群通过影响能量代谢、炎症反应、促进或抑制细胞的增殖分化，从而对人类健康产生了很大的影响，任何导致肠道菌群失调的因素都可能导致各种胃肠道疾病和肠外疾病。成熟稳定的肠道菌群可以协助人体能量摄取与代谢，促进免疫系统的发育、成熟和平衡，并且清除宿主肠道内的病原体，防止致病菌引起宿主感染。肠道菌群的失调可以直接影响着机体的免疫。

有研究表明，肠道微生态紊乱导致局部炎症反应，破坏肠道黏膜正常的屏障功能，进而可导致肠道内致病菌增殖并释放内毒素，进一步破坏肠道黏膜屏障^［1］。腹泻最易导致肠黏膜的受损，而肠黏膜损伤则会促使大量炎性促炎因子的释放，引发炎性反应，进而导致组织的炎症、水肿^［2］。通过图1、2发现，治疗后三步止泻手法组、补脾组、摩腹组及推上七节骨组、益生菌组能有效的改善组织水肿及胃肠的炎症情况；说明上述治疗组，均能降低腹泻兔胃肠组织损伤，缓解炎症状，从而改善腹泻症状。益生菌是治疗腹泻的常用微生态制剂，其在肠道形成生物菌膜，分泌肠道调节因子，起到生物学屏障保护作用，改善腹泻症状^［3］。促进胃肠道微环境改变，提升抵御细菌、病毒等病原体的能力，调节细胞因子表达，降低肠黏膜的炎症反应和氧化应激损伤^［4］。兔胃、肠病理切片染色提示，补脾组、摩腹组及推上七节骨组在改善兔胃肠组织时效果优于益生菌组、三步止泻手法组，说明各手法组在降低组织损伤，缓解炎症状，降低肠黏膜的炎症反应和氧化应激损伤的功效等同甚至优于益生菌。

通过表1发现，与正常组比较，模型组腹泻兔血浆内毒素的表达水平明显升高（P<0.05）；经过手法治疗后，与模型组比较，补脾组兔血浆内毒素的表达水平明显降低（P<0.05）；与模型组比较，三步止泻组、补脾组、摩腹组、推上七节骨组及益生菌组，兔血浆内毒素的表达水平也有不同程度的降低（P>0.05）。结果提示补脾法在降低兔血浆内毒素有良好的效果，而三步止瀉组、补脾组、摩腹组、推上七节骨组及益生菌组对降低兔血浆内毒素也有一定的作用。

当肠道遭受病原微生物侵袭时发生发炎性反应，导致肠道上皮细胞损伤及肠道菌群紊乱，从而使内毒素升高，本研究表明三步止泻组、补脾组、摩腹组、推上七节骨组及益生菌组可降低肠道对毒素的吸收，增强肠道屏障功能的作用机制，抑制内毒素的释放而诱发炎性反应，有效避免炎性反应扩大而加重肠黏膜损伤。

从肠道菌群的OTU/ASV分析、Alpha多样性分析中，我们可以发现摩腹组及三步止泻可纠正菌群紊乱，提高菌群的丰富度及均匀性，使肠道菌群尽快恢复稳态，恢复肠道内环境的平衡。丰富度及均匀性的增强能提升肠道黏膜生物屏障的作用，促进肠道蠕动，抑制致病菌群的生长，分解有害物质，激活免疫系统等，抵御病原体的继续入侵，同时修复受损的肠黏膜组织，抑制炎性反应，从而恢复肠道固有的健康状态。

参考文献：

［1］杨丽秋.推拿止泻三法治疗小儿腹泻的临床体会［J］.云南中医中药杂志，2011，32（9）：53-54.

［2］Bron PA，Kleerebezem M，Brummer ＲJ，et al.Can probiotics modulate human disease by impacting intestinal barrier function［J］.British Journal of Nutrition，2017，117（1）：93-107

［3］张燕.蒙脱石散联合双歧杆菌四联活菌片治疗小儿腹泻110例疗效分析［J］.中国药物与临床，2018，18（9）：1582-1583.

［4］赵爱玲.醒脾养儿颗粒联合双歧杆菌四联活菌片治疗小儿轮状病毒腹泻的临床效果［J］.临床医学研究与实践，2021，6（24）：139-141.

［5］蔡学宁，冯素诗，宋多灵，等.盐酸小檗碱联合双歧杆菌四联活菌治疗小儿感染性腹泻的效果及对肠道菌群的影响［J］.中国医院用药评价与分析，2020，20（1）：66-68.

（收稿日期：2022-08-25）