复发性流产妇女凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T多态性研究
2023-07-11郭跃丽汤丽云郑温洁莹陈孟权孔万仲王明山
郭跃丽,汤丽云,郑温洁莹,陈孟权,孔万仲,王明山
复发性流产的病因十分复杂,受遗传、内分泌、免疫、感染及子宫解剖结构等多种因素影响[1-2]。近年来研究发现,孕妇血栓前状态也是导致复发性流产的重要影响因素[3-4]。血栓前状态又称为易栓症,是一种血液高凝状态,引起全身弥漫性血栓形成,并进一步造成孕妇子宫胎盘或脐带血栓形成、梗死,引发流产[5-6]。对于复发性流产妇女,临床推荐进行血栓性基因突变筛查,以明确病因,并进行针对性治疗。目前研究发现,凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 多态性与血浆中凝血因子Ⅻ活性改变密切相关[7-8],但具体的机制尚不明确。本研究分析复发性流产妇女凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 多态性特点,为复发性流产的临床基因诊断提供参考,现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 回顾性收集2022 年1—6 月温州市中医院收治的138 例复发性流产患者(观察组)。纳入标准:(1)符合复发性流产的诊断标准[9];(2)连续3 次及以上妊娠28 周前发生自然流产;(3)进行凝血因子Ⅻ基因Exon1 测序;(4)病例资料完整。排除标准:(1)生殖道病原体感染;(2)子宫结构异常,如先天性子宫畸形、子宫颈机能不全、宫腔粘连及子宫肌瘤等;(3)内分泌疾病,如多囊卵巢综合征、甲状腺功能疾病及黄体功能不全等;(4)夫妻任何一方染色体异常;(5)自身免疫抗体检查异常。同期选取69 例妊娠史良好的健康女性(对照组),纳入标准:至少有1 次成功分娩,无流产史、早产史、产后出血史及妊娠合并症史。
观察组年龄25 ~41 岁,平均(31.3±3.5)岁;孕前 体 质 量 指 数 19.35 ~ 32.86 kg/m2,平 均(26.10±2.04)kg/m2;文化程度:初中24例,高中49例,大专及以上65 例。对照组年龄23 ~38 岁,平均(30.5±3.2)岁;孕前体质量指数18.96 ~31.05 kg/m2,平均(25.45±1.88)kg/m2;文化程度:初中10 例,高中24 例,大专及以上35 例。两组一般资料差异无统计学意义(P >0.05)。本研究经温州市中医院伦理委员会审批通过。
1.2 方法 所有受检者均采集空腹静脉血,一支采血管为乙二胺四乙酸抗凝,用于提取单个核细胞D NA 分析凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 多态性;另一支采血管为0.109 mol/L 枸橼酸钠抗凝,用于分离血浆检测凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原(FIB)及D-二聚体。
1.2.1 凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 多态性分析 使用苯酚-氯仿法提取血液中的单个核细胞DNA,干燥DNA 沉淀物置于-20 ℃保存待检。采用实时荧光定量PCR 扩增技术分析凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T,PCR 引物使用Primer Premier 5 软件 设 计,上 游引 物:5’-CCA GTCCCACTATCTAGAAAAG-3’,下 游 引 物:5’-CTATCAC AGCCATGAGCCAT-3’,产物长度594bp。反应条件:95℃预变性5 min,95 ℃变性40 s,64 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,72 ℃延伸10 min,总循环30 个,4 ℃冷却结束。检测仪器为伯乐CFX Connect Real-Time 实时定量PCR 仪(美国BioRad 公司)。使用Chromas 软件将测序结果与GenBank 基因库中公布的凝血因子Ⅻ基因序列比对,分析基因型和等位基因型。
1.2.2 凝血指标 采用法国Stago STA-R 全自动血凝仪(配套试剂由法国STAGO 公司提供)及凝固法检测PT、APTT 和FIB,采用SEKISUI CP-3000 全自动血凝仪(配套试剂由SEKISUI 公司提供)及免疫比浊法检测D-二聚体。
1.3 统计方法 采用SPSS 22.0 统计软件进行分析,采用Hardy-Weinberg 遗传平衡对样本的群体代表性进行分析,计量资料以均数±标准差表示,采用独立样本t 检验;多组比较采用方差分析,两两比较采用LSD 检验;计数资料采用2检验。P <0.05 表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 分布特点两组凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 的基因型分布均符合Hardy-Weinberg 遗传平衡定律(均P >0.05),具有群体代表性。在基因型分布上,两组CC、CT、TT 基因型频率差异有统计学意义(2=7.888,P <0.05),观察组CT基因型频率高于对照组(2=4.696,P <0.05),TT 基因型频率低于对照组(2=7.749,P<0.05),而两组CT 基因型频率差异无统计学意义(2=1.660,P >0.05),见表1。在等位基因分布上,观察组的C 等位基因频率高于对照组(P <0.05),T 等位基因频率低于对照组(P <0.05),见表2。
表1 两组凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 基因型分布 例(%)
表2 两组凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 等位基因分布 例(%)
2.2 两组不同基因型的凝血因子Ⅻ活性比较两组凝血因子Ⅻ活性差异无统计学意义(P >0.05),且两组CC、CT、TT 基因型的凝血因子Ⅻ活性差异均无统计学意义(均P >0.05)。同组内3 种基因型的凝血因子Ⅻ活性比较,CC 基因型凝血因子Ⅻ活性高于CT 和TT 基因型,且CT基因型凝血因子Ⅻ活性高于TT 基因型(均P <0.05),见表3。
表3 两组不同基因型的凝血因子Ⅻ活性比较 %
2.3 观察组不同基因型患者的凝血指标及凝血因子Ⅻ活性比较 观察组CC 基因型患者的APTT水平低于CT 和TT 基因型患者,且CT 基因型患者的APTT 水平低于TT 基因型患者(均P <0.05)。观察组CC、CT、TT 基因型的PT、FIB、D-二聚体水平差异均无统计学意义(均P >0.05),见表4。
表4 观察组不同基因型患者的凝血指标及凝血因子Ⅻ活性比较
3 讨论
复发性流产一直是妇产科研究的重点,近年来研究发现,复发性流产孕妇具有血栓形成倾向,纤溶功能降低而凝血功能增强,血液呈高凝状态[10-11]。凝血因子Ⅻ是一种由肝脏合成的丝氨酸蛋白酶,具有促进纤溶、抗血栓的作用[12-13]。目前分子基因学研究发现,不明复发性流产可能与凝血因子Ⅻ基因启动子区DNA 甲基化水平升高相关[14]。也有研究表示,凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 表达与凝血因子Ⅻ基因的翻译效率密切相关,进而影响凝血因子Ⅻ在血浆中的表达水平和活性状态[15]。
本研究分析复发性流产妇女凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 多态性特点,结果显示观察组的CT基因型频率高于对照组,观察组的TT 基因型频率低于对照组;且观察组的C 等位基因频率高于对照组,T 等位基因频率低于对照组(均P <0.05)。上述结果说明凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 为CT 基因型可能与复发性流产有关。国外有关凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 多态性的研究也证实CT 基因型可能是孕龄期妇女发生复发性流产的重要发病原因[16]。本研究进一步研究发现两组人群的凝血因子Ⅻ活性并无明显差异,但深入对比不同基因型的凝血因子Ⅻ活性,可以发现CC 基因型患者的凝血因子Ⅻ活性高于CT 和TT 基因型,并且CT 基因型患者的凝血因子Ⅻ活性高于TT 基因型,TT 基因型患者的凝血因子Ⅻ活性最低。这可能是因为凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 的T 等位基因发生突变,可使原始的起始密码子死亡碱基重新配对,形成新的起始密码子,并使下游的终止密码子也发生改变,使得凝血因子Ⅻ基因翻译提前结束,故携带C 等位基因的患者凝血因子Ⅻ活性明显上升,而T 等位基因的患者凝血因子Ⅻ活性明显下降。另外,本研究比较不同基因型的复发性流产妇女的血浆凝血指标发现,CC 基因型患者的APTT 水平低于CT和TT 基因型患者,且CT 基因型患者的APTT 水平低于TT 基因型患者,即CC 基因型患者的APTT水平最低,而TT 基因型患者的APTT 水平最高。这说明复发性流产妇女凝血因子Ⅻ活性越高与APTT 缩短存在关联。目前已有研究证实APTT与复发性流产密切相关,APTT 反映内源性途径凝血因子的缺陷,APTT 缩短,血液处于高凝状态,提示凝血亢进,会使子宫局部组织形成微血栓,造成胚胎缺血、缺氧,进而导致流产。胚胎死亡后发生自溶,激活内源性凝血途径,进而影响凝血功能。另外,妊娠期孕妇本身会出现生理性的血液高凝状态,加上凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 遗传病变,APTT 缩短,凝血因子Ⅻ活性增高,易发生血栓形成,梗塞子宫-胎盘,影响血流循环,胎儿在子宫内缺血缺氧,未得到及时供氧,造成胎儿死亡,引起流产[17]。本研究发现其他的凝血指标如PT、FIB、D-二聚体水平,不同基因型患者无明显差异,这可能是因为APTT是反映内源性凝血途径的指标,临床常用于测定内源性途径的凝血因子Ⅷ、Ⅺ、Ⅻ等[18]。
综上所述,凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 为CT 基因型可能与复发性流产有关,T 等位基因突变为C,引起凝血因子Ⅻ活性增高,APTT 缩短,导致血液高凝状态和血栓形成,梗塞子宫-胎盘,诱发流产。对于复发性流产妇女,临床可检测凝血因子Ⅻ基因Exon1-46C/T 多态性,进行基因诊断,明确病因,为妊娠保胎治疗提供参考。