乳腺癌患者外周血miR29a 的表达及临床意义

欧津瑞，高可欣，邹明明，孙平

1.牡丹江医学院，黑龙江牡丹江 157011；2.牡丹江市第二人民医院磁共振室，黑龙江牡丹江 157013；3.牡丹江医学院解剖教研室，黑龙江牡丹江 157011

乳腺癌是一种发生于乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤，据相关统计资料显示，2020年全球新发乳腺癌226.1 万，约占总体癌症发病的11.7%，新增死亡病例68.5 万，约占总体癌症死亡的6.9%[1]。由此可见，早期诊断乳腺癌并采取针对性治疗措施对改善患者预后、延长生存时间尤为重要。目前，临床尚缺乏早期诊断乳腺癌的肿瘤分子标志物，而随着分子靶向治疗乳腺癌成为新的突破方向和热点，多项研究表明，微小核糖核酸（miRNA）通过参与基因转录和蛋白翻译等多种生理过程，在乳腺癌肿瘤细胞分化程度、局部浸润等过程中扮演着重要角色[2-3]。miR29a 作为一种小分子非编码RNA，被证实参与了宫颈癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤的发病机制[4]。鉴于此，本研究选取2020年1 月—2022年12 月牡丹江市第二人民医院收治的30 例乳腺癌患者、30例乳腺良性增生患者及同期50 名健康志愿者，旨在探讨乳腺癌患者外周血miR29a 表达及与临床病理特征的相关性。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取本院收治的30 例乳腺癌患者（乳腺癌组）、30 例乳腺良性增生患者（乳腺良性病变组）、同期50 名健康志愿者为研究对象。乳腺癌组年龄38～76岁，平均（54.30±4.25）岁；体质指数（body mass index, BMI）18～29 kg∕m2，平均（25.08±1.22）kg∕m2。乳腺良性病变组年龄32～75 岁，平均（53.08±4.09）岁；BMI 18～28 kg∕m2，平均（24.86±1.19）kg∕m2。对照组年龄29～73 岁，平均（54.12±4.18）岁；BMI 17～28 kg∕m2，平均（25.02±1.17）kg∕m2。3 组研究对象一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经本院医学伦理委员会批准。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：经病理组织学检查确诊[5]，乳腺良性增生患者经乳腺彩超等检查确诊；无合并其他原位肿瘤。

排除标准：哺乳期或妊娠期妇女；合并严重自身免疫系统疾病者；肝、肾功能损害者；临床资料不完整者；组织标本污染或缺失者；合并严重认知障碍、精神系统疾病者；不能配合研究者。

1.3 方法

采用实时荧光定量PCR 法（qRT-PCR）测定外周血miR29a 表达，抽取3 组受试者空腹状态下外周静脉血5 mL，置于抗凝试管中，以15 cm 离心半径，3 000 r∕min，离心10 min 分离提取血清；采用TRIzol试剂（美国Invitrogen 公司提供）提取血清总RNA，按照miScript Reverse Transcription Kit（美国Biomiga公司）逆转录试剂盒使用说明书将其逆转录为cDNA，以U6 作为内参基因，使用Agilent Stratagene qRT-PCR 仪Mx3000P 进行qRT-PCR 实验，总反应体系：miScriptHispct（5×）4 μl，miScriptNucleics（10×）2 μl，miScript Reverse Transcriptase 2 μl，混匀，置于实时荧光定量PCR 仪扩增。反应条件：95℃15 min, 94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，70 ℃ 35 s，40 个循环，每个样品设3个复孔。采用2-△△CT法计算miR29a相对表达量。引物序列(5'→3'):5'-CTCAACTGGT GTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTAACCCAT-3'，U6：5'-TTCGTGAAGCGTTCCATATTTT-3'。

1.4 观察指标

①外周血miR29a 表达量比较。

②乳腺癌不同病理特征外周血miR29a 表达量比较。

③外周血miR29a 表达量与乳腺癌病理特征的相关性。

④外周血miR29a 表达量诊断乳腺癌的敏感度、特异度。

1.5 统计方法

采用SPSS 26.0 统计学软件处理数据，符合正态分布的计量资料采用（±s）表示，比较采用t∕F检验；计数资料采用[n(%)]表示，比较采用χ2检验；采用Spearman 分析外周血miR29a 表达量与乳腺癌病理特征的相关性；采用受试者工作特征（ROC）曲线分析外周血miR29a 表达对乳腺癌的诊断效能。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组受试者外周血miR29a 表达量比较

乳腺癌组患者外周血miR29a 表达量高于乳腺良性病变组和对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表 1 3 组受试者外周血miR29a 表达量比较(±s)

注：与对照组比较，#P＜0.05；与乳腺良性病变组比较，*P＜0.05

组别对照组（n=50）乳腺良性病变组（n=30）乳腺癌组（n=30）F 值P 值miR29a 表达量0.28±0.06（0.41±0.11）#（0.75±0.25）#*95.772＜0.001

表 2 不同病理特征患者外周血miR29a 表达量比较(±s)

表 2 不同病理特征患者外周血miR29a 表达量比较(±s)

病理特征年龄（岁）≥60＜60病理类型浸润性导管癌浸润性小叶癌髓样癌TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅳ期分化程度低分化中、高分化肿瘤直径（cm）≥3＜3淋巴结转移是否例数13 17 18 931 8 12 11 19 13 17 10 20 miR29a 表达量0.85±0.30 0.66±0.22 0.78±0.29 0.71±0.24 0.70±0.19 0.65±0.21 0.87±0.33 0.90±0.34 0.62±0.20 0.85±0.30 0.61±0.18 0.92±0.35 0.60±0.20 t∕F 值2.004 0.262 2.238 2.855 2.726 3.204 P 值0.055 0.772 0.033 0.008 0.011 0.003

图 1 外周血miR29a 表达量诊断乳腺癌的ROC 曲线分析

2.2 不同病理特征患者外周血miR29a 表达量比较

乳腺癌TNM 分期为Ⅲ～Ⅳ期患者miR29a 表达量高于Ⅰ～Ⅱ期患者，低分化患者miR29a 表达量高于中、高分化患者，肿瘤直径≥3 cm 患者miR29a 表达量高于直径＜3 cm 患者，淋巴结转移患者miR29a表达量高于无转移患者，差异有统计学意义（P＜0.05）；不同年龄、病理类型乳腺癌患者外周血miR29a 表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.3 外周血miR29a 表达量与乳腺癌病理特征的相关性

Spearman 相关性分析显示，外周血miR29a 表达量与乳腺癌患者TNM 分期、肿瘤直径、淋巴结转移呈正相关（r=0.294、0.335、0.402，P＜0.05），与分化程度呈负相关（r=-0.318，P＜0.05）。

2.4 外周血miR29a 表达量诊断乳腺癌的效能分析

ROC 曲线分析显示，外周血miR29a 表达量诊断乳腺癌的曲线下面积（AUC）为0.960（95%CI：0.917～1.000），最佳截断值为0.55，预测敏感度、特异度分别为83.3%、96.3%。见图1。

3 讨论

目前，临床关于乳腺癌的发病机制尚未完全阐明，多数学者考虑主要与遗传易感性、免疫功能紊乱、环境污染等多种因素共同作用有关[6-7]。由于该病临床表现、组织学形态、分子分型均具有强异质性，故早期诊断较为困难，随病情进展极易发生远处转移，患者整体5年生存率较低。miRNA 是一种主要存在于线粒体内的非编码小RNA，具有复杂的生物学功能，在多种疾病的表观遗传调控中发挥了显著作用[8-9]。相关基础研究也发现，不同种类的miRNA 在乳腺癌外周血中呈高表达或低表达现象，而miRNA 又对乳腺癌细胞的恶性生物学行为具有调控作用[10]。

miR29a 属于miR29 家族中一员，可调控机体细胞中参与细胞代谢、分化等过程中相关基因表达，在多种恶性肿瘤中异常表达，并与肿瘤细胞的恶性生物学行为密切相关[11-12]。研究指出，miR29a 可负向调控第10 号染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白（PTEN）基因，即miR29a 表达水平升高时，PTEN表达水平呈下降趋势[13]。张利超等[14]研究表明，miR29a 过表达可抑制胶质瘤的转移及侵袭，其作用机制主要是通过下调Spl 的表达实现的。另外，王绪娟等[15]研究表明，晚期乳腺癌化疗后预后不良患者血清miR29a 相对表达量为（0.95±0.27），显著高于预后良好患者的（0.65±0.14），进一步经回归分析显示，miR29a 相对表达量上调与患者化疗预后不良发生密切相关，有望成为乳腺癌靶向治疗的潜在靶点。

本研究结果显示，乳腺癌组患者外周血miR29a表达量高于乳腺良性病变组和对照组，且不同乳腺癌TNM 分期、分化程度、肿瘤直径及淋巴结转移患者miR29a 表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；进一步经Spearman 相关性分析显示，外周血miR29a 表达量与乳腺癌患者TNM 分期、肿瘤直径、淋巴结转移呈正相关，与分化程度呈负相关（P＜0.05）。说明乳腺癌患者外周血miR29a 表达水平显著升高，且在乳腺癌细胞生长调控、增殖恶变等过程中发挥了一定作用。本研究还显示，外周血miR29a 表达量诊断乳腺癌的敏感度、特异度分别为83.3%、96.3%。说明外周血miR29a 表达量对乳腺癌具有显著的诊断效能。

综上所述，乳腺癌患者外周血miR29a 表达水平显著升高，且与临床病理特征密切相关，可作为临床诊断乳腺癌的生物学指标之一。但本研究存在样本量不足等缺陷，今后需扩大样本量进一步探讨外周血miR29a 表达水平与乳腺癌的相关性。