不同麻醉预处理对肾脏缺血再灌注损伤模型的肾脏保护作用及分子机制研究

丛建军，付冬冬

1.吉林省通化市人民医院麻醉科，吉林通化 134001；2.河南省新乡市中心医院风湿免疫科，河南新乡 453000

临床上出现肾脏缺血再灌注损伤的现象不断增多，严重影响患者的生命和生活质量[1]。因此，在手术麻醉或者镇静过程中选择对肾脏缺血再灌注损伤具有一定保护作用的药物显得尤为重要。丙泊酚是麻醉及ICU 常用的镇静药物，已有研究报道该麻醉药物具有减轻多种脏器的缺血再灌注损伤作用[2]。瑞芬太尼作为μ 阿片类受体激动剂，剂量可控，安全可靠，对肝肾功能无损害，成为肝肾功能不全需要进行肾移植的理想麻醉药物[3]。七氟醚是目前临床常用的吸入麻醉药，具有诱导快、刺激性低的优点，且有利于术后麻醉的恢复，减轻心、脑、肝、肺等器官缺血再灌注损伤的作用已得到广泛认可[4]。目前对于上述3 种麻醉药物对肾脏缺血再灌注损伤的保护作用之间的比较以及作用机制鲜有报道。本研究于2019年1—6 月吉林省通化市人民医院，以60 只SD 大鼠为研究对象，建立肾脏缺血再灌注损伤模型，分析研究丙泊酚、瑞芬太尼、七氟醚对肾脏缺血再灌注损伤的保护及其分子作用机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 研究选择60 只雄性健康SD 大鼠，均为SPF 级，体质量（245.4±2.5）g；周龄（13.2±0.6）周；适应性饲养1 周（室温25℃、相对湿度40%～60%）。该实验所涉及的动物管理、使用以及相关操作均已通过动物伦理委员会（Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC）批准并严格遵循实验动物使用的3R 原则给予人道主义关怀。

1.1.2 主要试剂与仪器 丙泊酚注射液（国药准字J20080023；规格：20 mL∶0.2 g×5 支）、盐酸瑞芬太尼注射剂（国药准字H20143314；规格：2 mg∕支）、吸入用七氟烷（国药准字A000030209；规格：10 mL 溶液剂 支）、ELISA 试剂盒（货号:M1000B）、免疫组化试剂盒（货号:98-9943）、TUNEL 试剂盒（货号:ab66110）、兔抗大鼠多克隆p-ULK1 及兔抗大鼠单克隆p-AMPK、p-mTOR、Caspase-3（货号: sc-56053）。

1.2 方法

1.2.1 分组处理及模型建立 采用随机数字表方法将60 只SPF 级大鼠分为6 组:正常组（NC 组），假手术组（Sham 组）、缺血∕再灌注组（I∕R 组）、丙泊酚组（Pro 组）、瑞芬太尼组（Rem 组）和七氟醚组（Sev组），10 只∕组。I∕R 组、Pro 组、Rem 组及Sev 组根据相关文献建立肾脏缺血再灌注损伤模型。分组处理:术前所有大鼠需要禁食12 h，自由饮水。NC组、Sham 组及I∕R 组在模型建立前均给予生理盐水。Pro 组、Rem 组及Sev 组在手术前给予相应药物麻醉处理，其中Pro 组采用微量泵给予尾静脉输注丙泊酚[按照1.0 mg∕（kg·min）]，时间30 min；Rem 组以微量泵给予尾静脉输注瑞芬太尼[按照2.0 μg∕（kg·min）]，时间30 min。Pro 组、Rem 组模型制备前30 min 至再灌注后30 min 持续泵注给药。Sev 组在模型制备前30 min 吸入2.8%七氟醚和氧气的混合气体至再灌注30 min，气体监测仪测定大鼠呼出的七氟醚浓度。

模型建立:Sham 组经2.0%戊巴比妥钠（按照40 mg∕kg 给药）麻醉后开腹，游离出左右肾蒂，45 min关腹。I∕R 组、Pro 组、Rem 组及Sev 组经2.0%戊巴比妥钠（按照40 mg∕kg 给药）麻醉后，将两侧肾蒂游离，无创夹闭45 min 使得肾脏血流被阻断，模型复制成功标准:肾脏自暗紫色变为红色。

1.2.2 生化指标检测 大鼠处死前腹主动脉穿刺采血，冰上静置1.5 h 后，1 500 rpm×10 min 分离获取血清并置于-40℃冰箱中保存备用。大鼠肾功能指标包括尿素氮（BUN）、肌酐（Cr），应用TC6030全自动生化分析仪检测；炎症因子指标包括白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-8（IL-8），应用酶联免疫吸附法检测。采用亚硝酸法测定超氧化物气化酶（SOD）含量、硫代巴比妥酸法测定丙二醛（MDA）水平。

1.2.3 肾组织病理学及相关指标检测 再灌注24 h，采用2.0%戊巴比妥钠（按照40 mg∕kg 给药）麻醉后处死大鼠，分离取得肾实质，分别行免疫组化（SP法）检测自噬标志性蛋白（Beclin-1、LC3-Ⅱ），采用Quantity One 图像处理系统分析细胞凋亡情况，透射电镜检测自噬小体，蛋白免疫印迹法（Western blotting）检测肾组织自噬标志物。

1.3 观察指标

观察比较各组尿素氮（Blood urea nitrogen，BUN）、肌酐（creatinine，Cr）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素-8（Interleukin-8，IL-8）、超氧化物气化酶（superoxide gasification，SOD），丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平、细胞凋亡情况，肾组织自噬相关蛋白的表达。

1.4 统计方法

采用SPSS 22.0 统计学软件处理数据，符合正态分布的计量资料以（±s）表示，组间差异比较以t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组别生化指标检测结果对比

研究显示，I∕R 组BUN、Cr、IL-1β、IL-8、SOD、MDA 与NC 组、Sham 组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。Pro 组、Rem 组及Sev 组BUN、Cr、IL-1β、SOD与I∕R 组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。Sev 组BUN、Cr、MDA，与Pro 组、Rem 组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 不同组别生化指标检测结果比较(±s)

表1 不同组别生化指标检测结果比较(±s)

注：与NC 组比较，*P＜0.05；与Sham 组比较，#P＜0.05；与I∕R 组比较，▲P＜0.05；与Pro 组比较，△P＜0.05；与Rem 组比较，★P＜0.05

组别NC 组（n=10）Sham 组（n=10）I∕R 组（n=10）Pro 组（n=10）Rem 组（n=10）Sev 组（n=10）BUN（mmol∕L）6.23±0.69 6.85±0.81（24.18±2.91）*#（12.63±1.42）▲（16.25±1.85）▲△（8.60±1.54）▲△★Cr（μmol∕L）45.89±5.44 46.21±6.02（97.55±9.80）*#（78.93±7.89）▲（82.26±7.15）▲（68.22±7.08）▲△★IL-1β（mmol∕L）12.57±2.08 12.91±1.97（26.14±2.84）*#（17.76±2.33）▲（17.28±2.41）▲（16.92±2.28）▲IL-8（mmol∕L）8.65±1.43 8.76±1.50（10.59±1.83）*#9.97±1.96 10.11±1.82 9.88±1.79 SOD（U∕mg）14.26±2.05 13.21±1.88（6.24±1.64）*#（10.63±1.73）▲（10.22±1.80）▲（11.06±1.92）▲MDA（μmol∕g）1.39±0.45 1.42±0.50（4.73±0.79）*#4.16±0.72（3.70±0.64）▲（2.61±0.63）▲△★

2.2 免疫组化检测Beclin-1、LC3-Ⅱ表达对比

I∕R 组Beclin-1、LC3-Ⅱ水平，高于NC 组、Sham组，差异有统计学意义（P＜0.05）；Pro 组Beclin-1、LC3-Ⅱ水平，与I∕R 组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；Rem 组、Sev 组Beclin-1 水平，高于I∕R 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。Sev 组Beclin-1、LC3-Ⅱ水平，高于Pro 组、Rem 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 不同组别Beclin-1、LC3-Ⅱ表达水平结果比较(±s)

表2 不同组别Beclin-1、LC3-Ⅱ表达水平结果比较(±s)

注：与NC 组比较，*P＜0.05；与Sham 组比较，#P＜0.05；与I∕R 组比较，▲P＜0.05；与Pro 组比较，△P＜0.05；与Rem 组比较，★P＜0.05

蛋白名称Beclin-1 LC3-ⅡNC 组（n=10）0.198±0.067 0.232±0.072 Sham 组（n=10）0.214±0.058 0.258±0.061 I∕R 组（n=10）（0.392±0.078）*#（0.417±0.086）*#Pro 组（n=10）0.401±0.084 0.433±0.092 Rem 组（n=10）（0.609±0.102）▲0.442±0.101 Sev 组（n=10）（0.779±0.093）▲△★（0.859±0.090）▲△★

2.3 TUNEL 肾小管上皮细胞凋亡检测结果对比

TUNEL 检测试剂盒分析结果显示，I∕R 组AI（0.714±0.063），高于NC 组（0.209±0.072）、Sham 组（0.226±0.065），差异有统计学意义（P＜0.05）。Sev组AI（0.311±0.078）、Pro 组AI（0.496±0.081）、Rem 组AI（0.445±0.072），低于I∕R 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。Sev 组AI 水平，低于Pro 组、Rem 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 自噬小体检测结果对比

显微投射电镜观察显示，I∕R 组自噬小体数量（12.40±2.07），高于NC组（6.00±1.41）、Sham 组（6.20±1.30），差异有统计学意义（P＜0.05）。Sev 组自噬小体数量（24.60±5.73）高于I∕R 组，差异有统计学意义（P＜0.05），而Pro 组自噬小体数量（15.00±3.39）、Rem 组自噬小体数量（14.60±4.16），与I∕R 组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。Sev 组自噬小体数量，高于Pro组、Rem组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.5 pULK1、pAMPK、pmTOR 及Caspase-3 蛋白表达情况对比

研究显示，I∕R 组pAMPK、pULK1、pmTOR 及Caspase-3 均高于NC 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。Pro 组、Rem 组及Sev 组pmTOR 及Caspase-3低于I∕R 组，而pULK1 高于I∕R 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。Sev 组pAMPK、pULK1 高于Pro 组、Rem 组，而pmTOR 低于Pro 组、Rem 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 不同组别pULK1、pAMPK、pmTOR 及Caspase-3 蛋白表达结果比较(±s)

表3 不同组别pULK1、pAMPK、pmTOR 及Caspase-3 蛋白表达结果比较(±s)

注：与NC 组比较，*P＜0.05；与Sham 组比较，#P＜0.05；与I∕R 组比较，▲P＜0.05；与Pro 组比较，△P＜0.05；与Rem 组比较，★P＜0.05

蛋白名称pAMPK pULK1 pmTOR Caspase-3 NC 组（n=10）0.132±0.041 0.254±0.062 0.292±0.059 0.304±0.048 Sham 组（n=10）0.146±0.049 0.369±0.070 0.301±0.067 0.325±0.052 I∕R 组（n=10）（0.294±0.062）*#（0.375±0.076）*（0.781±0.094）*#（0.849±0.086）*#Pro 组（n=10）0.301±0.064（0.632±0.089）▲（0.594±0.083）▲（0.421±0.040）▲Rem 组（n=10）0.311±0.060（0.802±0.090）▲△（0.476±0.070）▲△（0.300±0.047）▲△Sev 组（n=10）（0.621±0.098）▲△★（1.042±0.116）▲△★（0.351±0.049）▲△★（0.285±0.031）▲△

3 讨论

自噬与多种疾病的发生发展密切相关[5-9]。研究显示，自噬参与多种疾病的发生发展，如肿瘤、脑缺血等，目前也有研究发现自噬可能对肾脏缺血再灌注损伤存在保护作用[10]。本研究显示，I∕R组BUN、Cr、IL-1β、IL-8、SOD、MDA 与NC 组、Sham组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。Pro 组、Rem组及Sev 组BUN、Cr、IL-1β、SOD 与I∕R 组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。Sev 组BUN、Cr、MDA，与Pro 组、Rem 组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），说明七氟醚降低肾功能指标（BUN、Cr）优于丙泊酚组、瑞芬太尼组，此外通过HE 染色结果显示，七氟醚组肾脏组织细胞排列较为整齐，空泡化少见，肾小管形态较完整，提示七氟醚对肾功能保护作用优于丙泊酚、瑞芬太尼。邹海波等[6]研究发现，与缺血组及再灌注组比较，异丙酚组的BUN（7.35±1.18）、Cr（45.15±3.35）、MDA（4.14±0.66）水平明显降低，SOD（479.12±81.35）水平明显增高（P＜0.05）。异丙酚可对大鼠肾脏缺血再灌注损伤产生保护作用。瑞芬太尼具有减轻氧自由基损伤，抑制细胞凋亡的作用，其作用机制与抑制Fas 表达以及降低Caspase-3 水平有关；金小雪等[7]发现瑞芬太尼通过对肾脏IR 后Fas 凋亡信号相关通路信号分子的抑制，阻断该通路的激活。七氟醚也具有减轻氧自由基水平，抑制细胞凋亡等作用，其可能机制与促进血红素（HO-1）基因表达有关[8]。以上提示，丙泊酚、瑞芬太尼以及七氟醚对于麻醉后大鼠具有一定的抗氧化应激作用，具体作用机制有待进一步深入研究。

本研究显示，I∕R 组细胞凋亡明显，Rem 组凋亡指数（AI）（0.445±0.072）低于I∕R 组（0.714±0.063）（P＜0.05）。Sev 组AI 水平（0.311±0.078）低于Pro 组（0.496±0.081）、Rem 组（0.445±0.072）（P＜0.05）。I∕R组及Sev 组自噬小体数量[（12.40±2.07），（24.60±5.73）]升高。I∕R 组pAMPK、pmTOR 及Caspase-3 分别为（0.294±0.062），（0.781±0.094），（0.849±0.086），均高于NC 组、Sham 组、Pro 组、Rem 组、Sev 组（P＜0.05）。以上提示，七氟醚对肾脏缺血再灌注损伤自噬作用优于丙泊酚、瑞芬太尼[9-11]。其中内源性途径的重要蛋白是半胱氨酸蛋白酶家族，如Capase-3 及Caspase-9 等[12]。研究显示，肾脏缺血再灌注时导致肾小管上皮细胞坏死性凋亡，导致Bax蛋白升高及Bcl-2 的下降，Capase-3 与凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2 存在相关性[13]。七氟醚、瑞芬太尼、丙泊酚等均具有降低Caspase-3 表达的作用。刘风藏等[14]的数据表明，肠道I∕R 诱导了明显的氧化应激和内质网应激相关细胞凋亡，表现为肠黏膜丙二醛增加，肠黏膜SOD 减少，细胞凋亡指数和mRNA增加。

综上所述，丙泊酚、瑞芬太尼及七氟醚均具有减轻肾脏缺血再灌注损伤的作用,其作用机制与抗氧化应激、抑制细胞凋亡有关。