蝴蝶豆种质资源芽期耐盐性筛选及评价

王燕茹　袁秉琛　孙郁婷　王志勇　虞道耿

关键词：蝴蝶豆；相关性分析；主成分分析；隶属函数；聚类分析

中图分类号：S541.9 文献标识码：A

世界上约20%的耕地属于盐碱地[1]。而土壤盐度是降低植物生产力的主要非生物胁迫之一，因此人们生产耐盐作物的必要性显而易见[2]。目前筛选种植耐盐植物是利用盐碱地最科学高效的方式[3]。众所周知，植物的耐盐强弱一般随不同物种和不同生长阶段而发生变化[4]。盐胁迫条件下，植物最敏感的阶段是芽期和苗期[5]。因而，对芽期或苗期的植物进行耐盐测试，能从大量材料中快速有效地筛选出耐盐种质。盐害主要是土壤可溶性盐分过高改变植物的细胞膜透性，使植物细胞失水，并阻碍植物进行光合作用，对植物的生长不利[6-7]，严重时致死。

蝴蝶豆是豆科距瓣豆属多年生缠绕性草本，具有根深、茎细、叶大、产量高不易木质化等特点，年产鲜茎叶可达30～45 t/hm2；营养丰富，适口性好，作为青饲料可为各种家畜提供高蛋白，也可晒制成干草[8]，是优良绿肥和覆盖植物、饲料[9]，生长管理粗放能在贫瘠的砖壤土中生长；并且它极其耐旱、耐荫，适口性好，可固氮，能抵御叶斑病和红蜘蛛侵害，抵制杂草入侵，具有极大的种植潜力[10-15]。目前已在草地早熟禾[16]、狗牙根[17]、豇豆[18]等多种草本、豆科植物的不同生育期开展了耐盐性鉴定与筛选。国内外对蝴蝶豆的研究主要包括其苗期耐盐[19]、抗旱[20]、高温胁迫[21]等一些抗逆性研究，但都未形成可靠有效的评价体系。严琳玲等[19]对20 份蝴蝶豆种质材料苗期进行不同盐浓度胁迫，将其分为2 类：耐盐型种质和不耐盐种质。相对于蝴蝶豆而言耐盐性研究略有欠缺，且作为优质牧草、绿肥能够更加广泛地应用于生产、生活中。故此，评估现有75 份蝴蝶豆属种质资源的耐盐性强弱，挑选出耐盐种质，大面积种植之后，不仅提高生产量也实现了高效利用盐碱地的目标。

本研究以75 份蝴蝶豆属种质为材料，盐胁迫针对芽期做处理，记录相关的形态，并利用隶属函数、主成分分析、聚类分析等评价方法对蝴蝶豆属种质萌芽期耐盐性进行评价，得出鉴定蝴蝶豆耐盐性的最适浓度和筛选耐盐性的指标，并对不同评价方法所得结果进行聚类分析，最终挑选出耐盐性较强的材料。为开发耐盐优异的蝴蝶豆资源和培育耐盐性强的新品种提供材料和理论支持，为前人研究进行补充。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用75 份蝴蝶豆种质由国家热带牧草种质资源中期（备份）库提供。包括CIAT 国外引进的资源和国内野外收集的资源，共1 属3 种75 份（表1）。

1.2 方法

1.2.1 盐胁迫浓度确定 从所有距瓣豆属种质资源材料中随机选取7 份，挑选均匀、饱满、健康的种子。采用培养滤纸法。盐（NaCl）浓度为：0、50、100、150、200、250 mmol/L，以50 mmol/L为梯度设置。每浓度处理3 个重复，每重复种子30 粒。种子用75%酒精浸泡15 min，再用10%的过氧化氢浸泡30 s 杀菌、消毒，再用清水清洗，打破种子休眠，待用。将种子均匀地置于90 mm的培养皿中，每处理添加10 mL 对应的盐溶液，放入培养箱中进行恒温培养（25 ℃，16 h 光照，8 h 黑暗，光强4000 lx）。每天记录种子发芽数，第6 天发芽停止，结束试验，测量其发芽率、发芽势、根长、芽长等。发芽标准：胚根长≥种子长度的1/2。

1.2.2 芽期耐盐种质筛选 确定适宜筛选浓度150 mmol/L，处理组加入10 mL 该浓度盐溶液，对照组加入等量的蒸馏水，每种质3 个重复，每个重复50 粒。种子处理方法同1.2.1，并测量相关指标：

发芽率=发芽的种子数/供试种子数×100%

发芽势=6 d 发芽的种子数/供试种子数×100%

发芽指数=Σ 每天发芽数/供试种子数

根冠比=根长/芽长

相对值=盐处理测定值/对照处理测定值

1.3 数据处理

采用Excel 和IBM SPSS 软件对所测数据进行处理和分析。计算每项指标的隶属函数值和平均隶属函数值，参考张会丽等[22]的方法；计算权重（W_j）和综合得分值（Z_j），参考刘丙花等[23]和李艳辉等[24]的方法，如以下公式所示。利用系统聚类法，将所有种质分类，得到种质资源聚类图。

2 结果与分析

2.1 筛选耐盐种质的适宜盐浓度

为了确定蝴蝶豆萌芽期耐盐的适宜筛选浓度，随机挑选7 份蝴蝶豆种质在不同盐浓度下进行处理。由表2、表3，图1 可知，当盐浓度为0～100 mmol/L 时，各组材料间的发芽势和发芽率大多在50%以上，相比差异均不显著；盐浓度为200～250 mmol/L 时，多组材料的发芽势均低于40%，发芽率均低于30%，且个别组的材料表现未发芽，由此可见盐浓度越高对种子萌发影响力越大甚至导致其死亡；但盐浓度在150 mmol/L时，各组材料的发芽势、发芽率均值为50%的约占1/2，这说明各种质在此浓度下表现差异显著，可有效区分各种质的耐盐差异性。因此，本研究借助发芽势、发芽率的显著差异性确定了蝴蝶豆耐盐种质的适宜筛选浓度为150 mmol/L 的盐溶液。

2.2 盐胁迫下蝴蝶豆种子萌发的影响

在150 mmol/L 盐胁迫下，75 份蝴蝶豆种质发芽指标中相对根冠比变异系数最大，为67.75%（表4）。这表明所測蝴蝶豆耐盐性相对根冠比变异比较丰富，存在较大差异，可以作为蝴蝶豆耐盐性评价指标。各种质的发芽率和发芽势集中在50%左右，根长和芽长小于15 mm 的种质分别占30%和50%（图2），说明盐胁迫对蝴蝶豆的发芽指标相对于根长、芽长来说影响较小，盐胁迫严重抑制了蝴蝶豆根和芽的生长发育。

2.3 盐胁迫下各指标的相关性分析

盐胁迫下，对各指标进行相关性分析（表5）表明，蝴蝶豆与发芽率、发芽势相关的任意2 个发芽指标之间均呈极显著正相关（P<0.01），其中发芽率与发芽势的相关系数最大，为0.992，发芽指数和相对发芽指数相关系数最小，为0.344。而芽长和根冠比以及相对值之间呈极显著负相关（P<0.01），且相关系数表示芽长与根冠比之间关系密切，系数最大，为?0.609，说明芽长越长根冠比、相对根冠比就越小，反之则越大。盐胁迫下蝴蝶豆萌芽期各指标间均存在着不同程度的相关性，因此可选择主要指标来评价蝴蝶豆种质的耐盐性。

2.4 主成分分析

在对蝴蝶豆所有发芽指标进行标准化后，再进行主成分分析，并根据每个成分的特征值和贡献率提取主成分（表6）。其中有4 个特征值大于1 的成分，因此将这4 个成分作为主成分，其特征值分别为5.20、2.99、2.06、1.39，方差贡献率为37.12%、21.37%、14.72%和9.95%。这4 个主成分累积方差贡献率达83.17%，超过了80%，说明因子的提取效果很好，涵盖了所有指标的大部分信息，整体归纳性好、综合反应性强，可将其作为蝴蝶豆耐盐种质评价筛选的综合指标。

由各主成分载荷矩阵（表7）可知，唯一对第一主成分产生负向影响的是根冠比且影响不大，其数值为?0.026，其余指标均对第一主成分产生正向影响。其中，影响最大的是发芽指数、发芽率、发芽势、相对发芽势，数值分别为0.872、0.865、0.855、0.789，说明发芽指数、发芽率、相对发芽指数及相对发芽势对第一主成分起主要正向影响作用。

对第二主成分产生正向影响的指标有发芽指数、发芽率、发芽势、鲜重、相对芽长、芽长、相对鲜重、根冠比，其余指标对第二主成分产生负向影响。其中，相对芽长、芽长起主要正向影响较大，数值分别为0.786、0.709；根长、相对根冠比、相对根长起主要负向影响，数值分别为?0.464、?0.835、?0.552；发芽指数、发芽率、发芽势、相对发芽指数对第二主成分影响不大。

第三主成分负向指标：相对发芽势、相对发芽指数、相对发芽率、芽长，其载荷值分别为?0.528、?0.613、?0.639、?0.018，其余均为第三主成分正向指标。其中，根长、相对根冠比、相对根长、根冠比对第三主成分起主要正向影响，数值为0.479、0.342、0.521、0.339；而相对发芽势、相对发芽指数、相对发芽率起主要负向影响；芽长对第三主成分影响可忽略不计。

第四主成分影响因素中鲜重、相对鲜重可忽略不计，负向影响因素有发芽指数、发芽率、发芽势、芽长，其余均为正向指标。其中，相对发芽势、相对发芽率、相对芽长、根冠比对第三主成分起主要正向影响，数值为0.300、0.333、0.444、0.662；而发芽指数、发芽率、发芽势、根长起主要负向影响。

2.5 蝴蝶豆耐盐性综合评价

对75 份蝴蝶豆种质耐盐性进行综合评价，将综合得分值和平均隶属函数值（ASF）作为评价耐盐性强弱的标准，综合得分值和ASF 值越大，表明其耐盐性就越强，反之则越弱。首先将蝴蝶豆发芽指标原始数据标准化后，借助公式（5）计算综合得分（Z=0.37Z1+0.21Z2+0.14Z3+0.09Z4）进行排序（表8）。综合得分值为?0.745～2.003，跨度范围大也表明各种质间耐盐性差异较大。排名前十的耐盐种质为：69＞2＞4＞12＞49＞1＞21＞6＞20＞18，排名后十的敏盐种质为：57＜55＜63＜45＜52＜54＜65＜30＜70＜73。这2 种评价方法都表达了蝴蝶豆的耐盐差异性较大。

然后对平均隶属函数值进行排序（表8），平均隶属函数值（不超过1）范围在0.14～0.61 之间，其值跨度范围大表明各种质间耐盐性差异较大。综合排名前十的种质为：59>67>12>20>2>4>1>69>75>49，综合排名后十的种质为：45＜63＜65＜30＜48＜31＜15＜57＜51＜55。用这2 种综合评价方法来评价蝴蝶豆的耐盐性，表明不同评价方法对75 份蝴蝶豆种质耐盐强弱的排名稍有不同，但大体差异不大，耐盐材料和敏盐材料的筛选结果基本一致。

2.6 聚类分析

综合得分值（Z）其包括信息全面，因此对蝴蝶豆耐盐综合得分值进行最远距离系统聚类分析，在欧式距离为4 处可将75 份蝴蝶豆种质分为四大类（图3）。第1 类为极耐盐种质，编号69单独分为一类；第2 类为耐盐种质，包括编号2、4、12、49、1、21、6、20、18、13、5、23、28、7、39、46、34 共17 份；第3 类为低耐盐种质，编号52、65、54、63、45、57、55 共7 份种质；第4 类编号29、10、59 等50 份材料为敏盐种质。

3 讨论

我国土壤盐渍化形势日益严峻，目前，最为经济、有效利用盐渍土的途径是种植耐盐植物对土壤进行生物改良[25]。蝴蝶豆在国内外作为优质饲料[26]和绿肥覆盖物[10-11]，其种质资源数量庞大、质量优异，遗传变异种类丰富多样，为开展蝴蝶豆种质资源的研究和创新提供重要材料基础。因此，系统性评价和利用耐盐性强的蝴蝶豆种质资源，对蝴蝶豆品种的选育具有重要的现实意义。本研究首先对7 份蝴蝶豆种质萌芽期在6个不同盐浓度下的研究发现，150 mmol/L 盐溶液胁迫下，蝴蝶豆表现出较大的耐盐性差异，因此确定该浓度为最适宜筛选浓度，与張红梅等[18]在豇豆耐盐性研究方面的结果一致。然后在150 mmol/L 浓度下，综合评价75 份蝴蝶豆属种质材料的耐盐性，研究表明，盐处理材料与对照相比，各种质的开始发芽时间普遍延迟了约1 d，该现象与田蕾等[27]对粳稻进行盐胁迫过程的表现一致，说明盐胁迫对植物芽期影响严重。

变异系数变化值较大的性状指标更能反映出材料间的耐盐性差异[28]。研究中，蝴蝶豆种质发芽指标中相对根冠比变异系数最大（67.75%），表明所测蝴蝶豆耐盐性相对根冠比变异比较丰富，存在较大差异，因此可作为蝴蝶豆耐盐性评价指标。通过相关性分析和主成分分析发现，发芽指数、相对根冠比、相对发芽率和根冠比这4 个指标与主成分关系最为密切，完全囊括了变异分析的信息，且包括蝴蝶豆耐盐特性的大部分信息，因此将这4 个指标作为耐盐评价指标。田蕾等[27]发现水稻芽期评价指标为发芽指数、相对根长和相对盐害率；孙璐等[29]确定根长、鲜重和发芽率作为鉴定高粱耐盐性指标。由此可以看出，发芽指数、根长、发芽率差异变化较大，可作为耐盐评价指标。研究发现，蝴蝶豆种质的根长和芽长均在25 mm 以下，且15 mm 左右的占比最大，发芽率和发芽势普遍在50%左右，由此可知，相对于种质发芽，胚根和胚芽的生长对NaCl 胁迫更为敏感，这与罗小燕等[30]对山蚂蝗的研究、杨林[31]对豆科牧草的研究结果一致，根长、芽长受盐胁迫影响最大。

相关性分析结果表明，蝴蝶豆在盐胁迫下，萌芽期各类指标间有不同程度的关联性，这与前人研究结果一致[32]，发芽率与发芽势相关任意2个指标间呈现极显著正相关（P<0.01），胚芽长和相对根冠比、根冠比相互之间呈极显著负相关（P<0.01）。本研究使用的各类指标对蝴蝶豆耐盐性综合评价贡献率不同，因此，要精确得出蝴蝶豆的耐盐性，应有更多的指标进行研究，再进行综合分析，这样才能全面反映蝴蝶豆种质耐盐性强弱。

本研究对综合得分进行聚类分析，将75 份蝴蝶豆属種质分为四大类，编号69 为第1 类极耐盐种质；第2 类为耐盐种质（编号2、4、12、49、1、21、6、20、18、13、5、23、28、7、39、46、34 共17 份）；第3 类为低耐盐种质（编号52、65、54、63、45、57、55 共7 份种质）；第4 类为敏盐种质（编号29、10、59 等50 份）。编号69 的蝴蝶豆种质通过平均隶属函数分析，得出其数值0.542，排名第8，综合分析得分2.003，排名第1，2 种评价体系下综合表现优异，最耐盐。但由于不同生长阶段，植物的耐盐性有一定的差异，所以萌芽期筛选出的耐盐种质能在苗期有何种表现需进一步验证。

4 结论

本研究通过不同盐浓度梯度筛选出最适浓度为150 mmol/L，在该浓度处理下测定75 份蝴蝶豆种质萌芽期相关耐盐指标，通过相关性分析、主成分分析、聚类分析对75 份蝴蝶豆种质耐盐性进行综合评价，确定蝴蝶豆耐盐评价指标是发芽指数、相对根冠比、相对发芽率和根冠比，结果表明，050321057 蝴蝶豆（编号69）在参试种质材料中表现出极其耐盐性。为蝴蝶豆耐盐性研究和选育耐盐品种提供理论支撑。