重度子痫前期患者外周血miR-221、miR-651-3p及杀伤细胞抑制性受体的表达意义

刘 荃,韦芳琴

0 引 言

子痫前期(preeclampsia,PE)是较为严重的妊娠期高血压疾病,是导致孕妇不良妊娠结局、新生儿死亡的重要原因之一[1]。根据器官损害程度,临床将PE分为重度PE和轻度PE,其中重度PE往往累及全身多个器官,会增加患者远期并发心血管疾病、代谢性疾病的风险[2-3]。当前,临床对重度PE的早期防控存在困难,选择合适的病理生理学生物标志物对重度PE进行诊断,对逆转孕妇不良妊娠结局具有重要意义。既往研究认为,PE的发生与滋养细胞侵袭异常、胎盘功能障碍、免疫因素等有关,而miRNAs作为一种基因调控分子,可调控相应靶蛋白的转录,参与PE发展过程[4]。miR-221可通过调控间质细胞分化参与子宫内膜蜕膜化过程,与滋养细胞浸润、子宫肿瘤的发展密切相关[5];miR-651-3p具有促进细胞迁移、侵袭的作用,可影响滋养层-内皮细胞相互作用[6]。同时证实,杀伤细胞抑制性受体(killer inhibitory receptor,KIR)水平变化与妊娠期高血压疾病的免疫应答异常相关[7]。当前,有关miR-221、miR-651-3p和KIR在重度PE患者外周血中的表达研究报道较少。本研究分析了重度PE患者外周血miR-221、miR-651-3p、KIR表达水平,并与轻度PE患者、健康孕妇对比,旨在为临床重度PE的早期评估及诊断提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料回顾性分析2019年3月至2022年8月于本院就诊的143例PE患者临床资料。纳入标准:①临床检查符合《妊娠期高血压疾病诊治指南(2020)》中有关PE的诊断标准[8];②孕妇均为自然受孕,单胎妊娠;③均于本院完成产检、生产。排除标准:①存在其他妊娠期合并症与并发症;②病情进展;③既往存在特殊药物服用史;④既往存在不良孕产史;⑤存在不良生活习惯。参考《妊娠期高血压疾病诊治指南(2020)》PE严重程度诊断标准将纳入研究患者分为轻度PE组(n=58)和重度PE组(n=85)[2];另选取同期于本院接受产检并生产的健康孕妇65例为对照组。本研究所有研究对象知情同意,且经医院伦理委员会批准。

1.2研究方法

1.2.1 外周血miR-221、miR-651-3p表达水平检测采用实时荧光定量聚合酶链(qRT-PCR)法检测。所有孕妇于妊娠28～34周产检时取空腹静脉血5 mL,EDTA抗凝后低温离心,-80 ℃保藏待测。总RNA提取:应用TaqMan miRNA ABC分离纯化试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司)提取样本总RNA,采用紫外分光光度计(DU800型,美国贝克曼库尔特有限公司)测定吸光度,吸光度为1.8～2.1的样本用于miRNAs检测。cDNA反转录:采用反转录试剂盒(日本Takara公司)将总RNA反转录为cDNA,-20 ℃保存备用。qRT-PCR法:应用miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒(天根生化科技有限公司)进行检测,PCR引物序列miR-221:上游5′-CAGCATTGTACAGGGCT-3′,下游5′-GAACATGTCTGCGTATCTC-3′;miR-651-3p:上游5′-TGGGATTCGATCAACAGAGAGT-3′,下游5′-CATACTGCCCCTCCCGTTTG-3′;以U6为内参,反应体系为20 μL,循环参数:95 ℃预变性15 min(1 cycles),95 ℃变性5 s、60 ℃复性40 s(40cycles)。miRNA表达结果采用2-ΔΔCt计算,每份样本检测3次,取平均值。

1.2.2外周血KIR表达水平检测取研究对象血液样本,采用酶联免疫吸附法检测KIR水平,全自动酶标仪(Bio Tek ELX-800,美国伯腾仪器有限公司)测定吸光度(A450)值,标准曲线计算样品浓度;试剂盒由上海仁捷生物科技有限公司提供,严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.3妊娠结局评估对孕妇进行随访,观察并记录母婴妊娠结局。出现早产、胎死宫内、胎盘早剥、胎儿宫内窘迫、HELLP综合征等,则认为存在不良妊娠结局[8]。根据孕妇妊娠结局将轻度PE组和重度PE组患者分为结局不良组和结局良好组。

2 结 果

2.1 基线资料比较3组PE患者一般临床资料比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。见表1。

表 1 3组一般临床资料比较Table 1 Comparison of general clinical data of the three groups

2.2外周血miR-221、miR-651-3p、KIR表达水平比较与对照组比较,重度PE组、轻度PE组外周血miR-221、miR-651-3p、KIR表达水平升高(P<0.05),重度PE组外周血miR-221、miR-651-3p、KIR表达水平均高于轻度PE组(P<0.05)。见表2。

表 2 3组子痫前期患者外周血miR-221、miR-651-3p、KIR表达水平比较Table 2 Comparison of peripheral blood miR-221, miR-651-3p and KIR expression levels in the three groups

2.3miR-221、miR-651-3p、KIR对重度PE的诊断价值分析ROC曲线分析结果显示,miR-221、miR-651-3p、KIR诊断重度PE的AUC值分别为0.836、0.835、0.879(P<0.05);当miR-221、miR-651-3p、KIR表达水平分别为1.43、1.70、52.13 μg/L时,诊断效能最高。见表3,图1。

表 3 miR-221、miR-651-3p、KIR诊断重度子痫前期的ROC分析Table 3 ROC curve analysis of miR-221, miR-651-3p and KIR for diagnosing severe PE

图 1 miR-221、miR-651-3p、KIR诊断重度PE的ROC曲线Figure 1 ROC curves of miR-221, miR-651-3p and KIR for diagnosing severe PE

2.4妊娠结局比较对照组发生早产1例,胎儿宫内窘迫1例,不良妊娠结局发生率为3.08%(2/65);轻度PE组发生早产3例,胎儿宫内窘迫5例,不良妊娠结局发生率为13.79%(8/58);重度PE组发生早产20例,胎儿宫内窘迫9例,胎死宫内1例,胎盘早剥2例,HELLP综合征1例,不良妊娠结局发生率为38.82%(33/85)。各组不良妊娠结局发生率比较,差异有统计学意义(χ2=31.022,P<0.001),且重度PE组不良妊娠结局发生率高于轻度PE组和对照组(χ2=10.562、26.310,P=0.001、<0.001),轻度PE组不良妊娠结局发生率高于对照组(χ2=4.713,P=0.030)。

2.5不同妊娠结局PE患者外周血miR-221、miR-651-3p、KIR表达水平比较轻度及重度PE患者中,结局不良组外周血miR-221、miR-651-3p、KIR水平均高于结局良好组(P<0.05)。见表4。

表 4 不同妊娠结局子痫前期患者外周血miR-221、miR-651-3p、KIR表达水平比较Table 4 Comparison of peripheral blood miR-221, miR-651-3p and KIR expression levels between PE patients with different pregnancy outcomes

2.6PE严重程度、miR-221、miR-651-3p、KIR与患者不良妊娠结局关联分析Logistic回归分析结果显示,重度PE、miR-221、miR-651-3p、KIR与PE患者不良妊娠结局有关(P<0.05)。见表5。

表 5 子痫前期患者不良妊娠结局的Logistic回归分析Table 5 Logistic regression analysis of adverse pregnancy outcomes of PE patients

3 讨 论

PE是一种多因素、多机制致病的疾病,目前公认的PE发病中心环节为“胎盘化不足”,胎盘滋养细胞侵袭不足引发子宫螺旋小动脉重塑障碍,使胎盘血流灌注减少,新生血管生成失衡,出现高血压和其他临床症状,最终引发PE[9]。滋养细胞在增殖、侵袭等方面与肿瘤细胞非常相似,随着对PE生物标记物研究的不断升入,越来越多的研究表明miRNAs不仅参与肿瘤细胞增殖、分化等生物学进程,也在滋养细胞侵袭过程中发挥重要作用[10]。除滋养细胞侵袭外,免疫效应异常也与PE的发生发展密切相关,KIR作为一种由NK细胞表达的跨膜蛋白,参与了NK细胞与T细胞活性调节,在子宫血管内皮损伤过程中发挥重要作用[11]。然而对于miR-221、miR-651-3p、KIR是否共同参与PE的发生发展尚不明确。

3.1miR-221水平与PE的关系miR-221位于X染色体p11.3区域,是在人脐静脉内皮细胞表达较为稳定的miRNAs,具有影响滋养细胞生长、侵袭和迁移的作用。陈嵘等[12]研究发现,过表达的miR-221可能通过抑制其靶受体的表达,发挥影响滋养细胞周期、调控细胞增殖的作用。本研究发现,外周血miR-221表达水平在对照组、轻度PE组、重度PE组中逐渐升高,且miR-221诊断重度PE的AUC值为0.836,敏感度、特异度分别为78.82%、91.38%,提示外周血miR-221水平变化可能与PE的病情严重程度有关,miR-221在评估重度PE方面具有良好的诊断价值。Yang等[13]应用CCK-8试验、Transwell侵袭试验和伤口愈合试验研究了miR-221在PE患者胎盘中的表达,发现miR-221的过度表达会促进人绒毛膜滋养层细胞系HTR-8/SVneo细胞的生长、侵袭和迁移,而敲除miR-221后则发挥相反的作用;同时,qRT-PCR和westernblot试验证实,miR-221可通过靶向调控血小板反应蛋白2影响滋养层细胞侵袭过程。既往研究表明,PE会增加不良妊娠结局的发生风险[8]。本研究结果也证实这一结论,即重度PE与患者妊娠结局不良呈正相关。本研究还发现,轻度及重度PE患者中,出现不良妊娠结局的患者外周血miR-221水平高于结局良好者,且miR-221水平与不良妊娠结局呈正相关。这可能与高水平的miR-221会使滋养层细胞功能下降有关[14]。

3.2miR-651-3p水平与PE的关系miR-651-3p也定位于X染色体上,是miR-651簇的成员,可通过调控转录因子的表达,在肿瘤发生、侵袭及转移中发挥重要作用,对滋养细胞侵袭内皮细胞进程也具有一定的促进作用[15]。本研究发现,重度PE组外周血miR-651-3p表达水平均高于轻度PE组和对照组,出现不良妊娠结局的PE患者外周血miR-651-3p表达水平更高,且miR-651-3p水平与PE患者不良妊娠结局呈正相关,提示miR-651-3p可能参与了PE的发生发展,高表达的miR-651-3p会增加不良妊娠结局发生风险。Yin等[16]基于lncRNA ATB/miR-651-3p/YY1信号通路,探究了滋养层-内皮细胞相互作用网络,发现YY1蛋白表达受到lncRNA-ATB和miR-651-3p的相反调节,高表达的miR-651-3p会在螺旋动脉重塑过程中抑制YY1蛋白表达,从而影响滋养层细胞的迁移、侵袭。有学者分析了重度PE患者胎盘miR-651-3p的表达水平及与临床特征的关系[17],发现miR-651-3p在重度PE患者胎盘中高表达,并与患者收缩压、乳酸脱氢酶等存在相关性,认为miR-651-3p水平可反映PE的严重程度。本研究ROC曲线分析结果显示,miR-651-3p诊断重度PE的AUC值为0.835,进一步表明miR-651-3p可用于临床重度PE的辅助诊断。

3.3KIR水平与PE的关系炎症反应与血管内皮损伤是PE的发病机制中的关键因素,NK细胞在血管内皮损伤、胚胎及滋养细胞免疫排斥反应中发挥重要作用,而KIR作为NK细胞表面的抑制性受体,可抑制NK细胞毒性,调节免疫排斥反应[18]。本研究结果显示,与对照组、轻度PE组比较,重度PE组KIR水平升高;与结局良好PE患者比较,出现不良妊娠结局患者的KIR水平升高,且KIR与患者不良妊娠结局呈正相关;ROC曲线分析结果显示,KIR对重度PE具有良好的诊断价值,表明KIR水平升高与PE病情加重、患者不良妊娠结局有关,其水平监测或可用于临床重度PE的诊断中。分析原因可能是:PE患者滋养细胞产生的人类白细胞抗原G表达水平降低,无法与KIR特异性结合,致使KIR表达水平显著上升,NK细胞毒性作用增强,影响滋养细胞浸润与血管重塑,加速疾病进展[19]。王晓艳等[20]研究也发现,妊娠期高血压疾病患者外周血KIR水平显著升高,有助于反映PE的严重程度。

综上所述,miR-221、miR-651-3p、KIR在PE患者外周血中表达水平升高,可能与患者PE严重程度及不良妊娠结局存在相关性;临床或可通过检测外周血miR-221、miR-651-3p、KIR水平,为重度PE的诊断提供参考。