骨关节炎患者外周血PKM2的表达水平及临床价值研究

李新颖,陈 凯,张延辉,唐 莉,甘 雨,李荣辉,金 红

(1.牡丹江医学院;2.牡丹江医学院附属红旗医院,黑龙江 牡丹江 157011)

骨关节炎(osteoarthritis,OA)是一种慢性的退行性关节疾病,调查发现OA好发于60～79岁的女性人群中[1]。该疾病主要引起软骨损伤、关节滑膜炎症和软骨下骨重塑。预计到21世纪30年代将达到总人口的1/4以上。并且由于老龄化和生活水平提升带来的肥胖问题,OA的患病率持续上升[2]。PKM2是丙酮酸激酶(PK)的一种同工酶,是具有一个果糖-1,6-二磷酸(FBP)结合口袋,使PKM2成为一个具有活性的四聚体,在催化糖酵解的过程中起到了关键作用[3]。研究表明,软骨细胞的功能维持以及细胞外基质的合成主要依赖于软骨细胞的ATP代谢平衡及能量储备,糖酵解代谢异常将导致细胞功能失调,甚至软骨细胞肥大化改变。PKM2作为糖酵解代谢的关键酶,在软骨细胞能量代谢紊乱这一过程中扮演重要角色,并由此参与骨关节炎的发病[4]。目前,国内外对PKM2在OA患者外周血中表达水平未见报道。本研究旨在探讨PKM2在OA患者外周血中的水平变化及临床应用价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象收集2020年12月至2022年12月期间经牡丹江医学院附属红旗医院诊断为骨关节炎并且符合入选标准的45例患者作为实验组,同时选取同期45 例健康体检者作为对照组。

实验组纳入标准:(1)牡丹江医学院附属红旗医院经过相关检查确诊为骨性关节炎的患者,诊断标准符合2018版中华医学会颁布的《骨关节炎诊疗指南》;(2)年龄40～80岁。排除标准:(1)排除患有类风湿关节炎(RA)、具有其他骨关节系统疾病病史的患者和近期曾接受临床过治疗的患者;(2)长期服用激素类药物的患者、糖尿病和患有肿瘤疾病患者;(3)血沉、类风湿因子以及抗O升高患者;(4)使用过免疫抑制剂及生物抑制剂的患者。

本研究通过了牡丹江医学院附属红旗医院伦理委员会批准审查,患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂 采用帝肯酶标仪infinite 200 PRO,试剂采用上海生工公司ELISA试剂盒,检测血清中PKM2表达水平。采用德国西门子BNII全自动蛋白分析仪,试剂采用全自动蛋白分析仪的配套试剂,检测类风湿因子(rheumatoid fator,RF)、C反应蛋白(c-reactive protein,CRP)、抗环瓜氨酸肽抗体(anti cyclic citrullinated peptide antibody,CCP)的表达水平。

1.2.2 收集血液样本 采集患者空腹状态下静脉血液3～5 mL至含有惰性分离胶、促凝剂的真空采血管中,充分混匀后,1 000×g离心10 min,收集上层血清置于-80 ℃冰箱冻存待检,用于检测PKM2、RF、CRP、CCP的表达水平。

1.2.3 血清中PKM2表达水平测定 采用ELISA方法检测,具体操作按说明书进行,在酶标仪450nm检测吸光度值。

1.2.4 血清中RF、CRP、CCP测定 将在-80 ℃冰箱冻存待检的血清放置于室温完全融化,上BNII全自动蛋白分析仪检测。

1.3 统计学方法采用SPSS 26.0分析并生成受试者工作特征曲线(ROC曲线);采用K-S检验对计量资料进行正态性检验;符合正态分布的计量资料,两组间比较采用两个独立样本t检验,以“均数±标准差”表示;非正态分布的计量资料,两组间比较采用Mann-Whitney U检验,结果用中位数和四分位区间表示[M(P25～P75)];采用ROC曲线分析诊断效能,以P<0.05,差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验组与对照组的基本资料比较实验组与对照组年龄、性别均无明显差异(均P>0.05)。血清中RF、CRP的表达水平在实验组与对照组之间无统计学意义(均P>0.05),见表1。

表1 实验组与对照组的基本资料比较

2.2 血清中CCP及PKM2的表达水平在实验组血清中CCP及PKM2表达水平高于对照组(P<0.05),见表2。

表2 实验组与对照组CCP及PKM2的表达水平

2.3 CCP及PKM2对OA的诊断价值根据CCP与PKM2在实验组与对照组的表达水平分别做ROC曲线。与CCP的ROC曲线下面积相比,PKM2曲线下面积最大,差异具有统计学意义(Z=4.18,P<0.000 1)。因此,PKM2在诊断性能上优于CCP。见表3,图1。

表3 CCP及PKM2的诊断效能

图1 CCP及PKM2单独检测的ROC曲线

3 讨论

OA作为常见的关节疾病,因其高致残率给社会带来了较大的经济负担。但由于其发病机制较为复杂,除了晚期关节置换外尚无有效药物或者手段逆转关节的退变[5-6]。Dres Damgaard等人[7],发现CCP在类风湿关节炎组表达水平要高于骨关节炎组且差异有统计学意义(P<0.05)。并且CCP在诊断类风湿关节炎时较为特异,但在国内外未见文献报道CCP在OA与健康成人组是否有差异。本研究中发现,CCP在OA与健康成人组(对照组)表达水平有统计学意义(P<0.05),CCP可能做为OA的一个潜在的风险因素。

PK是糖酵解关键酶,参与糖的有氧以及无氧氧化,催化磷酸基从磷酸烯醇式丙酮酸转移到ADP,生成ATP和丙酮酸。PK有4种蛋白亚型,分别为PKL、PKR、PKM1、PKM2,是由2个基因编码所产生,其中PKM2的活性受到多种因素的调控,使细胞适应不同的生理状态,在增殖活跃、分化程度低或者未分化的组织中表达活跃[8]。PKM2的催化效率很低,经猜想可能是PKM2高表达于增殖细胞中,导致磷酸烯醇式丙酮酸清除率下降,从而导致糖酵解的中间体增多[9]。近年来研究发现PKM2参与调控软骨细胞代谢,从而影响OA的发生与发展[10]。软骨细胞的功能维持以及细胞外基质的合成主要依赖于软骨细胞的ATP代谢平衡及能量储备,糖酵解代谢异常将导致细胞功能失调,甚至软骨细胞肥大化改变。PKM2作为糖酵解代谢的关键酶,在软骨细胞能量代谢紊乱这一过程中扮演重要角色[4]。研究发现,PKM2在OA软骨细胞中表达上调,将PKM2基因敲除后可影响软骨细胞的增殖、凋亡、细胞外基质及糖酵解[11]。炎症是机体应对感染、损伤的应激反应。在OA发病过程中炎症反应持续存在,白细胞介素-1β(IL-1β)是一种促进软骨降解的炎症细胞因子,在OA早期IL-1β大量表达[10]。将PKM2基因的敲除可以抑制软骨细胞中Rspo2/Wnt/β-catenin通路的表达,从而抑制一系列炎性细胞因子的释放[12]。在本研究中,与对照组相比PKM2蛋白在OA患者血清中的表达水平明显升高(P<0.05),其AUC及灵敏度高于CCP,但特异度CCP高于PKM2。

总之,PKM2影响着OA的发生发展。PKM2的表达水平可作为观察OA的治疗、疗效监测的一个重要指标,为明确OA的发病机制提供一个新思路。