ROR1和MAP1B与年龄相关性白内障的相关性

刘芳齐,胥 进,姚志伟,田 瑞,胡姗姗

(1.牡丹江医学院;2.牡丹江医学院附属红旗医院眼科,黑龙江 牡丹江 157011)

年龄相关性白内障(age-related-cataract,ARC)又称为老年性白内障,是以晶状体混浊为主要特征的一种眼部疾病。据估计,世界上近乎一半的失明是由白内障引起的[1]。因此,深入研究导致ARC发生发展的机制,找到早期预防、延缓甚至治疗的新靶点,对于最大限度地保护患者的视功能、提高生活质量,具有重要的现实意义。

受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(receptor tyrosine kinase like orphan receptor 1,ROR1)是一种I型表面跨膜蛋白,属于受体酪氨酸激酶(RTK)家族的一员。研究显示,由人类多能干细胞分化的晶状体上皮细胞中ROR1呈现高表达,这为以ROR1为靶点治疗人类白内障提供了新的方向[2]。然而,ARC作为一种最常见的眼部衰老性疾病,尚未有与ROR1相关的直接文献报道。微管相关蛋白1B(microtubule associated protein 1B,MAP1B)在神经系统中具有调节轴突伸长,维持微管稳定的功能[3]。在眼科相关疾病中,Wu等人[4]研究发现MAP1B介导的微管失稳可能是引起色素性视网膜炎的根本原因。另外,还有研究者发现,视网膜神经节细胞轴突中MAP1B的表达可以促进周围神经的再生[5]。然而,我们在前期的转录测序结果中发现,ROR1和MAP1B的mRNA在正常人与ARC患者的晶状体前囊膜组织中存在差异表达[6]。因此,ROR1是否可以通过调控MAP1B进而促进ARC发生发展的有待我们进一步研究。

本研究目的是通过观察ARC组和对照组中ROR1与MAP1B的表达及相关性,为ARC的发病机制以及早期预防、治疗的临床研究奠定基础。

1 对象与方法

1.1 研究对象收集2020年6月至2021年12月期间在牡丹江医学院附属红旗医院就诊并行白内障超声乳化手术的ARC患者20例。纳入标准:ARC组为皮质性白内障患者年龄在50～75岁,无眼部外伤或眼内手术史。对照组为同期眼外伤发生晶状体脱出的患者15例,年龄50～75岁。排除标准:高血压、糖尿病、角膜或视网膜疾病。样本收集均由同一眼科医生手术中撕除晶状体前囊膜时获取,取材后立即置于-80 ℃冻存备用。本研究收集的临床样本均经医院伦理委员会批准,取材前均经患者知情同意。

1.2 主要试剂与仪器兔抗ROR1一抗抗体、兔抗MAP1B一抗抗体购自美国Abcam公司、辣根酶标记山羊抗小兔 IgG(H+L)二抗购自北京中衫生物公司、PBS 缓冲液粉末、柠檬酸盐修复液、DAB试剂盒购自北京中杉生物公司。细胞培养箱购自美国Thermo Fisher公司、倒置荧光显微镜购自日本尼康、电泳仪购自美国BIO-RAD公司。

1.3 RT -qPCR取10～20 mg晶状体前囊膜组织,利用Trizol从中提取总RNA,分光光度计测定浓度和纯度,根据RNA的浓度计算出所需的RNA体积,配制反应混合物。采用逆转录酶试剂盒(Abclonal)将总RNA反转录成cDNATMII。RT-qPCR:根据制造商的方案Takara和SYBR Green进行:1个95 ℃循环30 s,40个95 ℃循环5 s和60 ℃循环20 s。每个样本设置3个复孔,重复检测3次。所有RT-qPCR反应均在ABI StepOneTM上进行,使用2-△△Ct法数据分析,引物序列见表1。

表1 所选基因引物序列

1.4 免疫组化及结果判定组织标本置于4%多聚甲醛固定,固定48 h以上用石蜡包埋后切片,将切片通过烤片、脱蜡、梯度酒精处理,柠檬酸钠缓冲液高温抗原修复,3%过氧化氢室温避光孵育10 min;磷酸盐缓冲液(PBS)浸洗3次;滴加FBS,室温孵育30 min。封闭后加入ROR1(1∶500)及MAP1B(1∶1000)一抗孵育,4 ℃冰箱保存过夜。每张切片PBS洗3次,滴加二抗在37 ℃温箱孵育1 h。PBS洗涤后,切片在DAB中孵育至所需染色强度。梯度酒精二甲苯脱水,中性树脂封片,使用正置显微镜捕捉免疫染色细胞的图像。

每张切片随机选取5个高倍视野(×200),每个视野计数50个细胞,根据阳性细胞比例和染色强度判断表达情况。阳性细胞百分比<10%为0分,10%～25%为1分,26%～50%为2分,51%～75%为3分,>75%为4分。染色强度无显色为0分,淡黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分。将二者评分相乘,0～1分为(-),2～4分为(+),5～8分为(++),9～12分为(+++);(+)～(+++)者为阳性表达。

1.5 Western blot使用蛋白裂解液裂解晶状体前囊膜组织,提取组织蛋白,BCA蛋白质测定试剂盒测定蛋白浓度。蛋白提取物每孔上样量40 μg,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后,转移至聚偏二氟乙烯过滤器(PVDF)膜上,5%脱脂牛奶37 ℃封闭1 h。一抗ROR1(1∶400)及MAP1B(1∶600)孵育并4 ℃冰箱过夜。洗膜后,加入二抗,在37 ℃摇床孵育1 h。采用化学发光试剂避光显影,曝光拍照。ImageJ软件分析扫描结果,每次实验结果独立重复三次。

1.6 STRING数据库分析STRING数据库(https://string-db.org/)检索ROR1和MAP1B蛋白,选择物种为人类,构建蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络。

1.7 统计分析所有统计数据均采用GraphPad Prism 9.0软件进行分析,Image J软件进行蛋白定量分析,定量资料以“均数±标准差”表示。采用单因素方差分析或t检验。以P< 0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ROR1与MAP1B基因的mRNA水平在ARC中呈现低表达RT-qPCR结果显示,如图1所示与对照组相比ARC组的ROR1和MAP1B基因的mRNA水平明显降低(图1,表1)。

图1 ROR1与MAP1B基因的mRNA水平在ARC组中呈现低表达

2.2 ROR1与MAP1B的蛋白水平在ARC中呈现低表达免疫组化显示,与对照组相比ARC组的ROR1和MAP1B蛋白水平明显降低(图2A,表3,表4)。Western blot显示,ARC组中ROR1和MAP1B的蛋白水平下降(图2B,表2)。

表1 两组基因的mRNA水平

表2 两组基因的蛋白水平

图2 ROR1与MAP1B基因的蛋白水平在ARC中呈现低表达

表4 两组MAP1B的蛋白表达水平比较

2.3 ROR1与MAP1B的相关性结果STRING数据库构建了ROR1与MAP1B蛋白的PPI网络,其中有5个蛋白与ROR1与MAP1B蛋白有显著的相互作用(P=3.7410-8),即巨轴索神经蛋白(gigaxonin,GAN),卷曲蛋白2(frizzled class receptor 2,FZD2),无翅型MMTV整合位点家族成员5A(Wnt family member 5A,WNT5A),以及细胞外基质丝氨酸蛋白酶(reelin,RELN)和WD和血小板活化因子乙酰水解酶1B调节亚基1(platelet activating factor acetylhydrolase 1b regulatory subunit 1,PAFAH1B1)(图3)。同时,PPI网络显示ROR1与MAP1B蛋白可能呈现间接调控关系。

图3 ROR1和MAP1B相关的蛋白网络图

3 讨论

目前,白内障只能通过手术来解决,一些新兴技术的发展使全球范围内手术率呈上升趋势[7]。但手术不可避免会导致术后并发症的发生,如眼表疾病、角膜内皮细胞的损伤和眼内炎等[8-9]。而且手术和耗材费用对社会及个人造成沉重的经济负担。因此,细胞和分子水平上的研究显得尤为重要。有文献表明,慢性氧化应激和人晶状体上皮细胞(HLECs)的凋亡被认为是白内障形成的机制[10]。ROR1基因最初是从成神经瘤细胞系中克隆得到的,它在多种肿瘤细胞中却呈现高表达状态[11]。因此,ROR1被认为是一种与细胞生长,凋亡和上皮-间质转化有关的基因。且ROR1敲低会导致增殖和迁移减少,但增强了对凋亡和疾病的抵抗[12]。Haider等人在研究视网膜转录因子Nr2e3功能时发现,ROR1可作为其靶点基因介导感光细胞的发育[13]。还有研究报道,在海马神经元中,ROR通过调控MAP1B的蛋白水平变化进而实现对神经突伸长的调节[14]。并且我们通过STRING数据库预测了ROR1和MAP1B蛋白间的相互作用,PPI网络显示ROR1与MAP1B蛋白可能呈现间接调控关系,但其中具体的调控机制有待于后续深入研究。

本研究结果显示,ROR1和MAP1B的mRNA和蛋白水平在ARC组中呈现低表达,这表明了ROR1和MAP1B参与了ARC的的发生。

综上所述,ROR1和MAP1B在ARC的发病中具有重要的意义,为预防甚至治疗ARC提供了重要参考价值。