北五味子藤茎精油EP-SFME法提取工艺优化及精油主要成分和抗氧化活性测定1)

孙宇 王金麟 贾树龙 李慧 魏菱鸽 路祺

(黑龙江生态工程职业学院,哈尔滨,150000) (东北林业大学) (黑龙江生态工程职业学院) (东北林业大学)

北五味子藤茎,民间常称为山花椒藤,为木兰科植物五味子(Schisandrachinensis(Turcz.) Baill.)的干燥藤茎,最早记载于《神农本草经》中[1]。《中华人民共和国药典》中规定,北五味子藤茎、果实、种子均可入药[2]。五味子精油具有清除自由基、改善记忆功能以及调节中枢神经[3-4]等功能。目前,北五味子的果实和种子的相关研究报道较多[5-7],而关于北五味子藤茎的研究却很少见,特别是对北五味子藤茎精油提取、以及藤茎精油组成分析方面的研究甚少。北五味子广泛分布于我国东北地区,为提高五味子的产量,每年都需要对人工栽培和野生的五味子藤茎进行剪枝,一般剪下的枝条质量相当于原藤质量的1/4～1/3,修剪下来的五味子藤茎,常被作为废料丢弃,或少量茎条用于调味,尚未做进一步开发利用,造成了极大的资源浪费。北五味子藤茎来源广泛且精油含量充足[8]。对五味子藤茎进行二次开发,可以避免资源浪费,实现资源再利用[9]。

精油提取通常采用传统的水蒸气蒸馏法,但提取时间长且能耗高,极易造成热敏性成分分解,同时精油产量也较低[10]。近年来,随着新的绿色提取技术的开发和应用,一些新型绿色提取方法(超临界二氧化碳萃取[11]、超声波萃取[12]、微波萃取[13]、微波空气蒸馏萃取[14]等)也用于精油提取。超临界二氧化碳萃取法对设备要求高,一次性投资大,且运行成本高;超声波萃取法对容器要求高,噪音大,放大困难;而微波提取法是一种通过微波能来实现快速提取的高效率新技术,它不仅可以提高植物精油的产量和质量,而且能源消耗也得到大幅降低;无溶剂微波辅助提取(SFME)是一种不添加任何其他溶剂,只利用原料本身所含的水分来提取植物精油的方法[15],这是一种更环保、更高效的植物精油分离技术;在精油提取过程中,细胞壁是阻碍精油分离的关键因素[16],采用酶预处理,可以有效地破坏细胞壁,促进内含成分有效迅速的释放。因此,酶法预处理与无溶剂微波萃取(EP-SFME)法相结合的创新方法可以实现更高效的精油绿色萃取。

本文以五味子藤茎为原料,其精油作为研究对象,通过水蒸气蒸馏法(SD)和酶解预处理联合无溶剂微波提取法(EP-SFME),提取五味子藤茎精油,同时利用单因素和响应面(BBD)试验方法,对EP-SFME提取工艺参数进行优化,利用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)对五味子藤茎精油组成进行定性、定量分析。通过测量1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基抑制活性、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)自由基抑制活性,以及抑制β-胡萝卜素的漂白活性,分析其抗氧化作用,并进一步分析五味子藤茎精油对乙酰胆碱酯酶的抑制活性,为五味子藤茎废弃物的开发利用提供理论支持,为其进一步开发利用提供参考。

1 材料与方法

北五味子藤茎材料采集于东北林业大学老山实验站,经东北林业大学植物学专业唐中华教授鉴定,为木兰科植物北五味子的藤茎。将新鲜的北五味子藤茎材料粉碎后,4 ℃条件保存备用。试验使用改良的微波提取器和精油提取器,气质联用色谱仪为7890A-5975C型气质联用仪(GC-MS),美国安捷伦科技有限公司。

2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(纯度≥99.0%,BHT)、β-胡萝卜素(纯度≥96.0%)、维生素C(纯度≥99.0%,VC)、没食子酸(纯度≥99.0%,GA)均购自上海麦克林生物技术有限公司。芦丁(纯度≥95.0%,RT)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(纯度≥95.0%,DPPH)、纤维素酶(50 U/mg)、乙酰硫代胆碱碘化物(纯度≥99.0%,ACHI)、5,5-二硫代双-2-硝基苯甲酸(纯度≥98.0%,DTNB)、乙酰胆碱酯酶(200～1 000 U/mg,AChE)、加兰他敏(纯度≥98.0%),均购自上海源叶生物技术有限公司。

酶解预处理联合无溶剂微波法(EP-SFME)提取北五味子藤茎精油。将30.0 g新鲜的北五味子藤茎粉放入烧瓶中,加入五味子藤茎质量2%的纤维素酶,在恒温水浴中50 ℃酶解2 h。将酶解后北五味子藤茎粉直接移到微波提取装置中,安装精油提取器,用480 W的微波辐照处理45 min,提取完毕后,回收精油提取器中精油溶液,使用分液漏斗静置4 h分层,获取上层精油,加适量无水硫酸钠脱水处理,将精油称量后,4 ℃避光储存备用。

水蒸气蒸馏法(SD)提取北五味子藤茎精油。将30.0 g新鲜的北五味子藤茎粉混悬于900 mL蒸馏水中,回流提取4 h,获得的精油与EP-SFME法获得的精油一起进行抗氧化活性与乙酰胆碱酯酶抑制活性的测定以及成分检测。

单因素实验。根据预试验结果,分析5个因素对北五味子藤茎精油产量的影响,包括酶用量(占五味子藤茎质量的0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%)、酶解温度(40、45、50、55、60 ℃)、酶解时间(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h)、微波辐照功率(140、280、420、560、700 W)和微波辐照时间(15、30、45、60、90 min),每个试验重复3次。

响应面试验。为了获得EP-SFME法提取北五味子藤茎精油的最优工艺条件,在单因素实验筛选的基础上,依据响应面法组合试验设计原理,采用3因素、3水平的响应面法试验设计(共计17组试验),优化EP-SFME方法的参数,并研究3个自变量的相互作用,其中自变量包括酶解温度、微波功率和微波时间,试验设计见表1。此外,用二阶非线性回归方程来表示精油产量的优化过程。

表1 响应面优化EP-SFME方法试验因素与水平设计

式中:Y为响应值,Xi和Xj为自变量,β0为常数项,βi、βii、βij分别为一次项、二次项和交互项的系数。

气相色谱-质谱分析条件。①色谱条件:色谱柱为HP-5MS(30.0 m×250 μm,0.25 μm);色谱柱起始温度50 ℃,以5 ℃/min的速度升至200 ℃,再以10 ℃/min的速度升至280 ℃,保持10 min;气化室温度280 ℃;色谱柱温度300 ℃;载气He;载气流量1.0 mL/min;分流比200∶1;进样量为1 μL。②质谱条件:电子轰击电离源(EI);电子能量70 eV;离子源温度250 ℃;四极杆温度150 ℃;扫描模式为Scan;扫描质量范围为30～550 u;溶剂延迟3 min。对检测出的成分采用MS数据库NIST11谱库进行定性,采用面积归一化法定量分析。

抗氧化活性测定。根据相关文献[17-20],配置不同质量浓度的精油,检测其DPPH自由基的清除活性、ABTS自由基清除活性、β-胡萝卜素的漂白抑制活性以及乙酰胆碱酯酶抑制活性。

数据处理。使用Origin2019b、Design-Expert 8.0.6和Excel2019进行数据统计分析,试验均重复3次,所有数据以平均值±标准差表示。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

纤维素酶可以通过将细胞壁和细胞间基质中的纤维素和半纤维素水解成葡萄糖来破坏植物细胞壁,进而减小植物活性成分扩散阻力,促进其释放[21]。表2为不同提取条件对北五味子藤茎精油产量的影响。由表2可见,精油产量随着酶用量的增加而提高,但当酶用量超过2.0%时,北五味子藤茎精油产量没有明显提高,因此,从降低成本的角度考虑,选择纤维素酶用量为2.0%。当酶解温度低于50 ℃时,随着酶解温度的升高,精油产量呈现增加的趋势,但当酶解温度高于50 ℃时,北五味子藤茎精油产量随着酶解温度的继续升高而降低,这是由于适宜的温度有利于酶活性提高,而过高的温度会破坏了酶的活性,导致北五味子藤茎精油产量的降低,因此,酶解温度50 ℃为最佳。当酶解时间为2.0 h时,酶解反应基本完成,酶解时间继续延长不利于精油的提取,反而精油产量呈现下行趋势,因此,酶解时间设定为2.0 h。已有研究表明,高的微波辐照功率有助于在短时间内实现植物精油提取[22]。然而,过高的微波辐照功率不仅会影响精油的质量,而且会使精油的回收变得困难[23-24]。随着微波功率逐渐增加,北五味子藤茎精油产量也随着增加,但当微波功率超过420 W时,精油产量开始下降,因此,微波辐照功率设定为420 W。随着微波照射时间的延长,北五味子藤茎精油的产量呈现先升高,后下降的趋势,当微波辐照时间为45 min时,精油产量达到最大值(3.24 mg/g),因此,微波辐照时间设定为45 min。

表2 不同提取条件的北五味子藤茎精油产量

2.2 响应面优化试验

以单因素实验结果为依据,采用响应面组合设计来进一步探讨酶解温度(A)、微波功率(B)和微波时间(C)对精油产量的影响。表3为精油产量的实际值和预测值。3个因素经拟合得到的二次多项回归方程如下:

表3 响应面分析及试验结果

Y=-18.496 25+0.615 75A+0.016 83B+0.093 33C-

0.000 104AB+0.000 2AC-0.000 031BC-0.005 65A2-

0.000 011B2-0.000 994C2。

表4是回归模型的方差和可靠性分析结果。模型的F值为45.75,P<0.000 1,说明该回归模型是显著的,可以用来模拟实际结果。本研究所获得的回归方程失拟项F值为1.29,说明该回归方程模型与实际结果拟合较好,其P值为0.391 6,不显著,该失拟结果可取,响应面组合设计合理。本研究所获得的回归方程模型的决定系数为0.983 3,其预测值为0.855 1,差值小于0.2,表明本回归方程模型可用于北五味子藤茎精油产量的预测。本研究所获得的回归方程模型精密度大于4,表明该模型区分度高。另外,回归模型具有较小的变异系数(1.55%),说明回归方程模型准确度越高,试验数据越可靠。综上所述,本研究获得的回归方程模型可用于分析酶解预处理联合无溶剂微波提取法对北五味子藤茎精油的提取。

表4 回归模型方差分析结果

通过单因素实验和响应面模型优化,获得最优工艺为:酶解温度50.96 ℃,微波功率471.47 W,微波时间44.71 min,酶用量2%,酶解时间2 h。在最优工艺条件下,二次多项回归方程模型预测北五味子藤茎精油理论产量为3.248 8 mg/g。考虑实际操作条件,最优北五味子藤茎精油提取工艺条件为:酶解温度50 ℃,微波功率480 W,微波时间45 min,酶用量2%,酶解时间2 h。在此条件下,北五味子藤茎精油产量为(3.21±0.03)mg/g。这与回归方程模型的预测值非常接近,也进一步表明本研究所获得北五味子藤茎精油提取工艺优化条件准确且可行。

2.3 精油提取中的能源消耗

EP-SFME法的提取时间为0.75 h,精油产量为3.21 mg/g,SD法的提取时间为4.00 h,精油产量为2.35 mg/g,可见,EP-SFME法提取精油的产量更高,耗时更短,能源消耗更少。此外,EP-SFME法在整个精油提取过程中不添加任何溶剂,也节省了大量水资源。由表5计算可知,利用EP-SFME法提取精油的过程中,每克精油能源消耗为4.78 kW·h,仅为SD法(56.74 kW·h)的8.42%。从提取效率、能耗消耗的综合角度考虑,与SD法相比,使用EP-SFME法提取精油更加合适。因此,EP-SFME法是一种非常绿色环保的提取工艺,具有很高的开发利用价值。

表5 不同提取方法的能源消耗

2.4 北五味子藤茎精油化学成分分析

由于酶解和微波的协同作用,EP-SFME方法提取的北五味子藤茎精油产量为(3.21±0.03)mg/g,水蒸气蒸馏法(SD)提取的北五味子藤茎精油产量为(2.35±0.04)mg/g,2种方法提取的精油中,已知成分占精油总量的比例分别为95.12%和94.68%(见表6)。由于含氧化合物和微波之间的强烈相互作用,EP-SFME法提取北五味子藤茎精油的含氧化合物峰面积占比(33.02%)明显高于SD法(15.63%)。通常情况下,植物精油成分中的含氧化合物在精油抗氧化活性中发挥着重要的作用[25]。图1显示了精油的GC-MS分析结果。EP-SFME方法提取北五味子藤茎精油的成分相对质量分数与SD方法相比,其成分的增量从大到小依次为橙花叔醇(7.58%)、4-萜醇(4.73%)、β-雪松烯(3.53%)、β-榄香烯(3.31%)、α-杜松醇(3.12%)、β-金合欢烯(2.75%)等。其成分降低量由大到小依次为α-蒎烯(17.12%)、沙本尼(5.05%)、3-蒈烯(4.11%)、别异长叶烯(2.06%)和白菖烯(1.72%)等。EP-SFME和SD方法所获得精油的主要活性成分是橙花叔醇(14.54%、6.96%)、β-榄香烯(8.19%、4.88%)、4-萜醇(7.74%、3.01%)等。在EP-SFME方法提取精油中,这3种主要成分的相对质量分数高于SD法提取的精油,其中EP-SFME法提取精油的橙花叔醇相对质量分数是SD方法的2.09倍,说明EP-SFME方法是一种很好的新鲜北五味子藤茎精油提取方法。

图1 用EP-SFME和SD方法提取的精油GC-MS色谱图

表6 通过GC-MS分析2种提取方法提取北五味子藤茎精油的化学成分

2.5 精油抗氧化活性分析

半抑制浓度(IC50)定义为抗氧化剂对自由基清除率达到50%时,抗氧化剂的质量浓度。IC50值越低,抗氧化剂清除自由基能力越强。北五味子藤茎精油抗氧化结果见表7,在1～10 g/L的范围内,北五味子藤茎精油对自由基的清除能力与其质量浓度呈正相关。SD法提取精油、EP-SFME法提取精油以及阳性对照品Vc对DPPH自由基的IC50值分别为3.350、2.520、0.011 g/L,对ABTS自由基的IC50值分别为4.22、2.32、0.01 g/L。β-胡萝卜素漂白抑制活性通常用于评价精油的抗氧化能力[26]。SD法提取精油、EP-SFME法提取精油以及阳性对照品2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚对β-胡萝卜素漂白能力的IC50值分别为9.53、4.45、0.06 g/L。结果表明,与SD法相比,EP-SFME法提取的北五味子藤茎精油具有更强的抗氧化活性。这是由于EP-SFME法提取北五味子藤茎精油中富含含氧化合物,使其具有强的抗氧化活性,这也被精油GC-MS分析结果所证实。

表7 EP-SFME和SD法提取精油的抗氧化活性和乙酰胆碱酯酶抑制活性

2.6 乙酰胆碱酯酶抑制活性分析

抑郁症是发病率较高的一种精神疾病[27]。据世界卫生组织的统计,全世界有超过3.5亿人受到抑郁症的影响[28]。越来越多的研究表明,精油及其化学成分对中枢神经系统有影响,包括治疗阿尔茨海默病和帕金森病[29]。精油中脂溶性小分子容易穿过血脑屏障,可以对抑郁症起到治疗作用[30-31]。同时,精油的芳香气味也可以直接刺激嗅觉神经,从而迅速调节大脑功能[32]。另外,精油通常具有良好的乙酰胆碱酯酶抑制活性[33-35]。目前,还没有关于北五味子藤茎精油对乙酰胆碱酯酶活性抑制的相关研究报告。

北五味子藤茎精油对乙酰胆碱酯酶抑制活性结果见表7,随着精油质量浓度的增加,对乙酰胆碱酯酶抑制活性也随之增加。EP-SFME法提取精油、SD法提取精油,以及加兰他敏对照品对乙酰胆碱酯酶的IC50值分别为0.064 4、0.172 3和0.011 3 g/L。EP-SFME法提取的北五味子藤茎精油对乙酰胆碱酯酶具有更强的抑制能力,这应与它具有更高相对质量分数的橙花叔醇成分有关。这也表明EP-SFME方法提取的北五味子藤茎精油在抗抑郁药方面更有优势。

3 结论

本研究首次采用酶解预处理联合无溶剂微波法提取北五味子藤茎精油,并通过单因素和响应面法优化,获得北五味子藤茎精油最优提取工艺条件:酶解温度为50 ℃,微波功率为480 W,微波时间为45 min,酶用量为2%和酶解时间为2 h。在最优条件下,北五味子藤茎精油产量为(3.21±0.03)mg/g。

GC-MS结果表明,新鲜北五味子藤茎精油的主要活性成分是橙花叔醇、β-榄香烯和4-萜醇。在EP-SFME法提取的精油中,这3种成分相对质量分数明显高于SD法提取的精油,特别是橙花叔醇的相对质量分数是SD法提取的精油中的2.09倍。另外,EP-SFME法和SD法提取的精油中,含氧化合物峰面积占比分别为33.02%、15.63%。表明EP-SFME法提取新鲜北五味子藤茎精油不仅产量高,而且富含含氧化合物。

通过DPPH自由基清除能力、ABTS自由基的清除能力、β-胡萝卜素漂白抑制活性和乙酰胆碱酯酶抑制活性研究发现,与SD法相比,EP-SFME法提取的新鲜北五味子藤茎精油具有更强的抗氧化活性和乙酰胆碱酯酶抑制活性。由于含氧化合物和微波之间的强烈相互作用,使得EP-SFME方法提取新鲜北五味子藤茎精油含有更多的含氧化合物,赋予其更强的抗氧化活性和乙酰胆碱酯酶抑制活性。表明EP-SFME方法是一种更具有优势的提取新鲜北五味子藤茎精油的方法。本研究为新鲜北五味子藤茎废弃物的开发和利用提供支撑和数据参考。