望江南茎中大黄素提取工艺优化、纯化及鉴定1)

周昊 杨瑾 张玉红

(吉林大学,长春,130026) (东北林业大学)

望江南(SennaoccidentalisL.)为豆科(Fabaceae)决明属(Senna)草本植物,又名山角豆、野扁豆、喉白草、羊角豆[1]。望江南茎中含量最多的成分为黄酮及蒽醌类化合物[2-3],目前利用蒽醌类物质开发抗癌药物备受关注尤其是针对肝癌的研究[4-5]。而大黄素为望江南中含量丰富的蒽醌类物质之一[6],除了作为一种常用的泻药[7],还具有多种药理学活性包括治疗伤口愈合[8-9]、抑制促炎细胞因子活性[10-11]、抑制肝癌HepG2细胞[4]和显著性抑制金黄葡萄球菌活性[12]。已有对大黄素的提取分离研究主要集中在微波提取[13]、双水相萃取、正交试验提取、超声辅助提取[14]等。而对望江南植物的研究主要集中于对种子中总蒽醌的提取工艺优化[15],对其中大黄素的单一研究较少。对其提取工艺优化主要集中在对温度、时间和提取溶剂等方面的考量,没有依据大黄素这类物质本身的化学性质进行优化。本研究根据大黄素在植物中容易以苷元的形式与多种糖类结合的性质,在提取过程中加入无机酸来探讨提取率的优化。

此外,降低pH值能使得大黄素从结合态转变为游离态从而能提高提取效率[16]。并且已有的研究中还未有从望江南中分离纯化大黄素的方法。本研究采用响应面法优化大黄素提取工艺,同时根据蒽醌类物质易溶解于碱液的性质[17],结合质谱分析大黄素的结构和裂解方式,建立了一种从望江南中分离、纯化大黄素的方法,为进一步研究及开发利用望江南提供科技支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

取望江南植株地上茎部分,清理干净,常温干燥后粉碎,过40目筛后,密封、放置干燥处备用。

大黄素标准品,HPLC级,纯度大于98%,上海源叶生物科技有限公司;望江南茎40目粗粉,蒸馏水为实验室自制;无水乙醇,盐酸,三氯甲烷,氢氧化钠,乙酸乙酯,石油醚,碳酸钠,碳酸氢钠,柱层析硅胶(200目),薄层层析硅胶板,分析纯,均为上海麦克林公司。

电子分析天平,型号BSA124S-CW,北京赛多利斯科学仪器;紫外可见分光光度计,型号UV-2250,日本岛津公司;电子分析天平,型号TE2101-L北京赛多利斯科学仪器;中药粉碎机,型号WND-200A,浙江省伟能达仪器;旋转蒸发器,型号RE-52AA,上海亚荣生化仪器厂;循环水真空泵,型号SHZ-D(Ⅲ),河南省予华仪器;恒温水浴锅,型号SYG-2,常州朗月仪器;高效液相色谱仪,型号1260,美国安捷伦公司;液相质谱仪,型号Q-focus,美国赛默飞世尔公司。

1.2 试验方法

大黄素定量检测。采用分光光度法定量测定大黄素含量[18]。精密称取大黄素标准品5 mg置于100 mL容量瓶中,加乙醇溶解摇匀、定容,配成50 mg/L的母液。取大黄素标准品母液,依次配置成质量浓度为5、10、16、20、30、40、50 mg/L的溶液,分别移取1 mL不同质量分数的标准品溶液于10 mL的容量瓶中,加入5 mol/L的氢氧化钠溶液1 mL,去离子水定容至刻度,摇匀,放置10 min。以空白溶液为对照,在530 nm处用紫外分光光度计测定并记录其吸光度值。

提取溶液的筛选。精密称取1 g同一批次望江南茎粉,分别用20 mL水、乙醇、乙酸乙酯、正己烷于30 ℃浸提30 min,取浸提液过滤,加入5 mol/L等量氢氧化钠溶液,摇匀放置10 min后测定其吸光度值并依据大黄素标准曲线计算其质量分数。

单因素提取试验。精密称取1 g同一批次望江南茎粉末,采取控制单一变量的方法,料液比为1 g∶20 mL,利用热回流方法进行提取,分别对盐酸用量、乙醇体积分数、提取时间和提取温度进行考察。设置梯度分别是:每20 mL提取液盐酸用量为0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL;乙醇体积分数为20%、40%、60%、80%、100%;提取时间为20、30、60、90、120 min;提取温度为70、75、80、85、90 ℃。提取液过滤后,取上清液3 mL,加入5 mol/L等量氢氧化钠溶液,摇匀,放置10 min,测定吸光度。

响应面优化。在上述单因素试验的基础上,运用Design-Expert V.12软件设计试验的同时对得到的试验数据进行回归分析。选取盐酸用量、乙醇体积分数、提取时间和提取温度作为实验因素,以望江南茎中大黄素的得率为响应值(Y)。根据Box-Benhnken Design试验设计,进行4因素3水平的响应面试验,共计29组(表1)。

表1 响应面试验的因素和水平

1.3 大黄素纯化及鉴定

大黄素粗品的获得。利用优化后的提取条件获得大黄素提取物,采用梯度pH萃取法,首先使用氯仿萃取后,加入5% Na2CO3溶液震荡混合均匀,分离出紫红色的碱液层,反复操作数次至碱液不再变红,以除去大黄酸。将分离后的氯仿层与5% Na2CO3溶液混合,分离出变红的碱液层,多次重复操作至无红色,合并得到的碱液层,加入盐酸至pH值为6左右,一边滴加酸液一边摇动,以避免液体反应不均匀冲出瓶口,静置直到瓶底不再有沉淀产生,抽滤得沉淀,反复用水洗后用氯仿进行复溶,得到大黄素粗品。

柱层析制备及大黄素纯化。采用湿法装柱干法上样的方法进行柱层析。取规格为300 mm×30 mm的玻璃层析柱,将硅胶30 g与洗脱剂混合均匀后加入柱内,敲击柱身减少气泡后加压使填料平整。将经过pH梯度分离的溶液与少量硅胶混合后旋转蒸发至无液体干粉状态加入层析柱平铺在填料上,使用少量洗脱剂完全浸润。

用V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=30∶1～V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=25∶1体系洗脱,使用365 nm紫外灯照射观察有明显黄色色带,收集该色带馏分,使用薄层层析硅胶板对比标准品大黄素检查为单一黄色斑点,将馏分浓缩后,氯仿溶解进一步进行重结晶,可以得到纯度较高的大黄素。

大黄素鉴定及质谱分析方法:

①定量分析。利用赛默飞OTCML中药成分高分辨质谱数据库中compound discovery软件、mzvault软件及本地数据库检索识别,并人工排查和补充,明确望江南中可能的蒽醌类化学成分,经过面积归一法进行定量。

②色谱条件。安捷伦C18色谱柱(250.0 mm×4.6 mm,5 μm),柱温30 ℃,进样量10 μL,流动相为甲醇(体积分数80%)+0.1%乙酸水溶液(体积分数20%),流速1.0 mL/min,检测波长为285 nm。

③质谱条件。色谱柱为HypersilGoldtmVanquish柱(100.0 mm×2.1 mm,1.9 mm),电喷雾离子源正负离子模式(ESI),毛细管温度350 ℃,喷雾电压4 000 V,鞘气、辅助气和S-lens射频水平的流量分别为80、40、0,扫描范围(m/z)为150～1 500,分辨率为70 000。流动相为体积分数0.1%甲酸水(A)+甲醇(B),梯度洗脱:0～1 min,为98%A(98%的甲酸水);1～9 min,98%A→2%A(流动相甲酸水从98%降到2%);9～12 min时,达到2%A(2%的甲酸水);12.0～12.5 min内,2%A→98%A(流动相甲酸水从2%升到98%);12.5～15.0 min内,达到98%A(98%的甲酸水);流速0.35 mL/min。柱温40 ℃,进样量为5 μL。

1.4 数据处理

使用Microsoft Excel软件对试验数据进行整理,利用Origin 2021软件对数据进行统计分析和图形绘制,采用One-way ANOVA方法进行单因素方差分析。每次试验重复3次。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

按照1.2的试验方法,进行紫外分光光度法测定。以吸光度值为纵坐标,大黄素质量分数为横坐标,绘制标准曲线,呈线性关系。标准曲线的回归方程为y=0.003 9x+0.012 1,相关系数R2=0.999 0。结果表明,该标准曲线在大黄素质量浓度在5～50 mg/L,呈现较好的线性关系。表明该方法线性关系较好,适用于对大黄素进行检测。

图1 大黄素的标准曲线

2.2 提取溶剂的筛选

在其他条件相同的情况下,分别用水、乙醇、乙酸乙酯和正己烷4种不同极性的溶剂对望江南中大黄素进行提取,从表2中可以明显看出,其中以乙醇为提取溶剂所得到的大黄素的得率最高,并且乙醇安全无毒。因此,选用乙醇作为从望江南茎中提取大黄素的最佳溶剂。

表2 不同提取溶剂种类的大黄素得率 mg·g-1

2.3 单因素试验

2.3.1盐酸用量对望江南茎中大黄素提取得率的影响

从表3可知,随着盐酸用量的增多,望江南茎中大黄素提取得率呈逐渐上升趋势,当盐酸用量为1.6 mL时,大黄素提取得率达到最大,随盐量用量继续增加,大黄素提取得率下降。通过降低pH值既可以将望江南中的大黄素从其衍生物中以苷元的形式解离,同时也可以将以盐形式存在的大黄素完全游离,从而提高大黄素的质量分数,但是过高的盐酸体积可能会导致大黄素的饱和,同时也促进了大黄素的不稳定性。因此,每20 mL提取溶剂加入1.6 mL盐酸为单因素提取的最优值。

2.3.2提取时间对望江南茎中大黄素提取得率的影响

随着提取时间的延长,大黄素提取率先上升后下降,当提取时间为90 min时达到峰值(表3)。提取时间再延长,大黄素的得率会下降,可能是时间过长会发生部分氧化和结构上的破坏,因此提取最优时间为90 min。

2.3.3 乙醇体积分数对大黄素提取得率影响

从表3可知,随着乙醇体积分数的升高,望江南茎中大黄素的提取得率也随之增大,当乙醇体积分数为80%时,大黄素的提取得率达到最大,当乙醇体积分数继续上升时,大黄素的得率呈现下降的趋势。乙醇体积分数过大会增加其他杂质的溶出,从而导致大黄素的提取率下降。因此,提取望江南茎中大黄素最优乙醇体积分数为80%。

2.3.4 提取温度对大黄素提取率影响

随着提取温度升高,大黄素的提取得率先上升后下降,当提取温度达到85 ℃时,大黄素的得率达到最高,随后开始下降(表3)。温度提高能加速大黄素的溶解,但是当温度达到一定高度时,提取率则会下降,可能是因为造成提取溶剂的挥发和大黄素部分氧化分解。因此,提取大黄素的最优温度为85 ℃。

2.4 响应面法优化试验

2.4.1 响应面优化结果分析及模型建立

为进一步了解各提取因素之间的相互作用,在上述单因素实验结果的基础上,选取盐酸用量、乙醇体积分数、提取时间和提取温度,以大黄素含量作为响应值,利用Design Expert V12软件,结合4因素3水平的Box-Behnken方法设计实验并进行优化。试验结果见表4。

表4 Box-Behnken试验设计与结果

利用Design-expert软件对表4中的数据进行分析,以望江南茎中大黄素得率(Y)为响应值,对表4中的数据进行多项回归拟合,得到以响应值为目标函数的二次多元回归方程:

Y=9.80+0.012 3A+0.870 9B+0.061 1C+0.057 2D-0.039 7AB-0.038 4AC-0.115 3AD-0.229 4BC-0.410 2BD+0.338 4CD-0.468 2A2-1.294 5B2-0.499 0C2-1.070 1D2。

一次项系数值的大小可以反映因素对响应值的影响程度[13],由回归方程可得出提取大黄素的主次影响因素由大到小为:乙醇体积分数、盐酸用量、提取时间、提取温度。这也与表5中模型的方差结果相一致。

表5 回归模型各项方差分析

2.4.2 因素交互分析

响应面的陡峭程度说明影响因素对响应值的影响大小。从3D响应面图可以看出,各个因素对大黄素提取得率的影响程度。响应曲面坡度越陡峭,表明交互作用越明显[14]。图2c和图2e的响应面较为陡峭,底部投影接近圆形,说明提取时间和盐酸量以及提取温度和提取时间交互作用较显著[19]。随着提取时间、盐酸量和提取温度的增加,大黄素的提取率呈现先增加后减小的趋势,在盐酸量为1.6 mL提取温度为86 ℃提取时间为90 min时得率最大,之后逐渐降低。而图2a和图2d坡度较缓,表明提取温度、提取时间对乙醇体积分数的交互作用较弱。

图2 各因素交互作用的响应面图

2.4.3 提取条件的优化及验证试验

运用Design Expert 12软件,通过上述回归方程得到望江南茎中提取大黄素最优条件:盐酸用量2 mL,乙醇体积分数87.62%,提取时间86 min,提取温度为84.4 ℃,大黄素得率9.50 mg/g。考虑到实验操作的便利性,将优化条件校正为:盐酸用量2 mL,乙醇体积分数88%,提取时间86 min,提取温度为84 ℃,使用同一批次望江南茎粉平行试验3次,大黄素得率的平均值为9.44 mg/g,变异系数为0.633 6%,经方差分析,差异不显著,表明该回归方程模型的可靠性较好,可以用于预测实验结果,也表明采用响应面优化望江南茎中大黄素提取工艺条件是合理可行的。

2.5 大黄素检测和鉴定

按上述最优提取条件,进行望江南茎中大黄素的提取,得到的大黄素提取物按照1.3的方法进行大黄素纯品的制备,获得大黄素纯品的样品,进行色谱和质谱鉴定。

液相色谱分析。将m(大黄素样品)∶m(标准品)=1∶1混匀,按照1.3中的色谱条件进行HPLC的检测,大黄素样品与标准品混合物仅出现一个峰,且相临没有其他峰出现,且保留时间为3.99 min,与大黄素标准品的保留时间4.11 min基本一致(图3),并且峰形较好,杂质较少,表明样品与标准品是同一物质为大黄素。经与标准品相比对,纯化后得到的大黄素样品中大黄素质量分数为95.8%。

A.样品:标准品质量比为1∶1;B.标准品。

质谱分析。按照1.3的条件,将纯化后的大黄素样品进行质谱检测。由于大黄蒽醌类化合物在电喷雾电离条件下容易失去H+而带负电荷,因此在负离子模式下检测结果更明显,所以在负离子模式下,从图4可以看出,母离子质谱峰质荷比为269[M-H]-,离子失去中性分子CO及一个氧原子得到质荷比241[M-H-CO]-,质荷比225[M-H-CO-O]-。根据负离子模式下精确相对分子质量和二级质谱碎片信息,与文献比对一致[20-21],确定为大黄素。

图4 大黄素LC-MS2扫描图(负离子模式)

根据已有文献推测大黄素最有可能的两种裂解方式,如图5。其中A过程为碳环羰基裂解,从能量上看,该方式裂解键能小产物能量低,结构会更稳定[22]。B过程中羟基断裂脱去CO的特征离子碎片,因为羟基连接碳与邻位碳正负电荷差最大,离去程度高更容易断裂[23]。

图5 大黄素质谱裂解途径过程(负离子模式)

3 结论

在单因素试验的基础上,采用四因素三水平的响应面法优化望江南茎中大黄素的提取工艺条件为:盐酸用量2 mL,乙醇体积分数88%,提取时间86 min,提取温度为84 ℃。在此最优条件下,从望江南茎中获得大黄素提取物,采用梯度pH萃取法得到大黄素粗品,利用湿法装柱干法上样的柱层析法,并用V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=30∶1～V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=25∶1体系进行洗脱,氯仿重结晶,得到大黄素纯品。经质谱和HPLC定性定量鉴定,大黄素质量分数为95.8%。本研究改进了从望江南中提取和纯化大黄素的工艺,操作更快速和效率,同时建立了在望江南中大黄素的鉴定方法,对望江南的开发利用具有参考价值和重要意义。