蜂蜜植物源毒性成分检测技术研究进展

刘珈伶，韦 环

（广西-东盟食品检验检测中心，广西南宁 530022）

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物混合后，经充分酿造而成的天然甜物质。蜂蜜除含有大量葡萄糖、果糖等糖类物质外，还富含维生素、蛋白质及有机酸等营养成分[1]。其具有抑菌消炎、抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等作用[2-3]，是深受公众喜爱的药食同源食物。随着人们对蜂产品需求量的不断增加，蜂蜜质量安全问题引发大众关注，食用蜂蜜中毒恶性事件引发了民众恐慌。蜂蜜本无毒，但在生产过程中被污染或蜜蜂采集有毒花蜜酿制的蜂蜜，可能会引起中毒[4-5]。我国广西、云南和贵州等地均有食用有毒蜂蜜而引发食源性疾病的报道[6-7]。食用有毒蜂蜜后会引发如头晕头疼、呕吐腹泻、四肢麻木、呼吸中枢麻痹等中毒症状[5-7]，甚至引发休克死亡，据统计野生蜂蜜引发中毒的死亡率在20%以上[8-9]。

蜂蜜有毒物质主要来源于蜜蜂采集有毒蜜源植物花粉。《食品安全国家标准 蜂蜜》（GB 14963—2011）中规定“蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露应安全无毒，不得来源于雷公藤、博落回、狼毒等有毒蜜源植物”。但标准未列出具体植物源毒性成分和相关检测方法。国内对有毒蜜源植物如雷公藤属、博落回属和钩吻属等毒性成分关注和研究较多[10-12]。但我国地大物博，除了上述有毒蜜源植物之外，还有毛茛科的乌头属、百合科的藜芦属和茄科的曼陀罗属等多种毒性较高的毒源植物[5]。要预防和控制此类事件发生，快速准确检测出蜂蜜中植物源毒性成分十分重要。本文梳理了近年来报道的蜂蜜中主要的植物源毒性成分，对其前处理方法和检测技术的特点和研究进展进行了综述，以期为提高蜂蜜中植物源毒性成分监测水平提供帮助，助推蜂产业的高质量发展。

1 蜂蜜中的植物源毒性成分及其分类

含有天然毒素成分的植物种类繁多，毒性成分和中毒临床表现各异。生物碱和萜类化合物是最常见的天然毒素。生物碱（Alkaloid）是存在于自然界中的一类碱性含氮有机化合物，结构多变，数量庞大，目前已发现的天然生物碱化合物就有2 万种以上[13]。分布最广的为吡咯里西啶生物碱（Pyrrolizidine Alkaloids，PAs），目前已发现超过600 多个不同结构的PAs 及其N-氧化物，存在于世界各地的6 000多种植物中，大部分PAs 对人体肝脏有毒[14]。萜类化合物（Terpenoids）是自然界中分布广泛的天然产物之一，双环倍半萜内酯类、二萜皂苷类和松香烷型二萜等是蜂蜜植物源毒性成分的来源。植物源毒性成分的化学结构复杂多变，增加了研究难度。本文梳理了近年来国内外文献报道的有关蜂蜜植物源毒性化合物，并按结构进行分类，如表1 所示。

表1 蜂蜜中植物源毒性化合物名称及分子式信息

由表1 可见，已报道的毒性物质中PAs 及其N-氧化物占近五成，其次是具有中枢神经毒性的二萜类和吲哚类生物碱。这些毒性化合物毒性大，中毒症状急，致死率高，是研究的重点。对于数目庞大的PAs 要逐一制定安全限量并不科学，欧盟2020 年新修订的（EC）No. 1881/2006 以21 种PAs 总和正式设定了花粉等部分食品中PAs 的限量。尽管未涉及蜂蜜，但为开展蜂蜜中毒性物质研究和制定合理限值提供了思路。

2 蜂蜜中植物源毒性成分的前处理

蜂蜜糖分高、黏度大、基质干扰强，样品前处理技术成为准确检测毒性成分的关键。传统前处理技术有溶剂提取法、液液萃取法等，普遍存在操作步骤烦琐、有机溶剂消耗量大、净化能力弱等缺点。随着前处理技术的迅速发展，固相萃取、加速溶剂萃取、顶空固相微萃取等新兴技术在蜂蜜植物源毒性成分检测中获得了良好的应用。本文重点介绍应用最为广泛的固相萃取技术，包括分散固相萃取法、磁性固相萃取法、离子交换固相萃取法等。

2.1 分散固相萃取

分散固相萃取技术也称QuEChERS，简便快捷，操作方便，应用广泛。PAs 的N-氧化物极性较大，为便于后期分析需要用锌粉在净化时还原成游离的PAs[19,29]。还原法提高了PAs 含量，增加了检测灵敏度，同时减少了PAs N-氧化物标准物质的使用，某些无标准物质的N-氧化物也能被检测到。在进行广谱筛查时，常采用如NaCl+PSA 的简易QuEChERS法，减少吸附剂复杂造成的损失[12]。QuEChERS 法可以根据净化目标物不同，选择适宜的分散剂。例如，中性氧化铝适合芳香胺类化合物的萃取，张元元等[30]使用中性氧化铝提取雷公藤甲素。石墨化炭黑（Graphitized Carbon Blacks，GCB）对于平面分子或者含有平面芳香环的分子具有强烈的吸附作用，ROMERA-TORRES 等[25]使 用GCB 提 取 蜂 蜜 中9 种莨菪烷类生物碱。QuEChERS 法灵活便捷，已在蜂蜜基质中多种植物毒素的广谱性提取净化中得到广泛开发和研究，专属性依净化目标物的不同予以调整。

2.2 磁性固相萃取

磁性固相萃取是以功能化超顺磁性纳米粒子（Magnetic Nanoparticles，MNPs）为吸附材料，只需要一个外部磁场即可从各种溶液基质中分离目标物。该方法简单快捷，易操作，专属性强，适用于分离复杂基质中的痕量目标物。段苏然等[31]采用MNPs改良了QuEChERS 技术净化，提取蜂蜜中雷公藤红素和雷公藤甲素，减少了因PSA 吸附造成的损失和C18对雷公藤甲素电负性的影响。

2.3 离子交换固相萃取

离子交换固相萃取适用于带电化合物，大部分生物碱带正电荷，混合型阳离子交换固相萃取（MCX）[4,22]和强阳离子交换固相萃取（SCX）[15,17,20]电负性强，易发生阳离子交换。MCX 能提供反相吸附和阳离子交换双重作用力，对碱性物质保留能力更强，在生物碱中应用更广。使用MCX 提取PAs 时常以稀酸-甲醇为溶剂[22]，但马桑亭类、闹羊花类毒素等会因甲醇共流出而损失。为兼顾更多生物碱，韦环等[4]将溶剂换为水，在PAs、马桑亭和闹羊花等20 种不同类别植物毒素的净化中得到较好应用。

3 蜂蜜中植物源毒性成分的检测技术

蜂蜜的植物源毒性成分种类多，毒源范围广，各种化合物结构复杂，同分异构体多，检测难度大。其检测方法主要包括基于视觉感官检测的蜂蜜孢粉学[11,21-22]、色谱检测技术和酶联免疫吸附技术[18]等。蜂蜜孢粉学能提供蜜源信息，但无法对毒性物质定

性和定量。酶联免疫吸附技术需要抗原与抗体有特异反应，目前还无法达到多有毒物质同时检测。色谱技术具有强大分离功能，操作方便，条件温和，方法多样，使得多毒素同时定性定量成为可能。薄层色谱法是简单的色谱分析方法，操作简便，早期也用于快速检测植物毒素，但灵敏度不高，分离能力有限，对部分毒性物质的专一性不够，目前已被其他分离能力更高的技术所取代。

3.1 高效液相色谱法

高 效 液 相 色 谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是用于分析高沸点不易挥发的、热不稳定有机化合物的重要分离分析技术。一般采用C18作为分离柱，甲醇/乙腈-水作为流动相检测蜂蜜中的植物毒素[11,21]。降低柱温对分离有利，HUNGERFORD 等[15]使用5 ℃的低温HPLC 实现昆士兰蜂蜜中Indicine 和Lycopsamine 两种PAs 的立体异构体分离。HPLC 与二极管阵列检测器（Photo-Diode Array，PDA）联用时，可得任意时间的光谱图，相当于与紫外联用[21]。但HPLC 基质干扰严重，灵敏度不足，因此逐步被色谱质谱联用技术所取代。

3.2 气相色谱串联质谱法

气相色谱串联质谱（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）适宜分析小分子、易挥发、热稳定的化合物，商业化的质谱数据库检索功能实现了未知/已知物的定性。GC-MS 对目标物分子量和热稳定性要求高，部分毒性物质的质谱数据库匹配度低，部分数据库中缺乏对应信息的N-氧化物，定性困难。

3.3 超高效液相色谱串联质谱法

超高效液相色谱串联质谱法（Ultra Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）的质谱一般是指低分辨率的四极杆（QQQ）和离子阱（Trap）质谱。它对高沸点、不挥发和热不稳定化合物在定性、定量分析方面具有特殊优势，是蜂蜜中毒性物质检测最通用和最有用的方法。大气压电离化学电离离子源（Atmospheric Pressure Chemical Ionization，APCI）不能生成一系列多电荷离子，一般用于弱极性、小分子有机物。如PAs 的N-氧化物极性强，需要还原后使用APCI 源检测蜂蜜中PAs 总量[20]。ESI 源是主要的离子源，多位学者建立了ESI 模式下，采用多反应监测（MRM）测定PAs、雷公藤毒素、马桑毒素的定量方法[19,27,31]。离子阱质谱可得到多级质谱离子碎片，用于推导未知化合物结构。SIXTO 等[16]采用3 种离子检测模式在没有分析标准的情况下定性和定量蜂蜜中毒性最大的PAs。低分辨率质谱虽然痕量分析准确，但基质干扰严重，不能有效区分目标化合物和干扰化合物，存在假阳性。

3.4 超高效液相色谱-高分辨质谱法

高分辨 质 谱（High Resolution Mass Spectrum，HRMS）提供的精确质量信息可以用来确定离子峰的元素组成，比低分辨质谱仪定性结果更准确，灵敏度更高，类型包括四极杆飞行时间串联质谱（Triple Quadrupole-Time of Flight Mass Spectrometer，Q-TOF MS）、 静 电 轨 道 阱 质 谱（Orbitrap Mass Spectrometer，Orbitrap MS）、傅立叶变换质谱等。其中，傅立叶变换质谱价格高昂难操作，应用少。Q-TOF MS 和Orbitrap MS 分辨能力和价格同比略低，但质量范围宽、扫描速度快、维护简单，是最常见、普及最广的高分辨质谱。超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF MS）可提供瞬时高精度全谱谱图，信息量全。相较而言TOF MS 分辨率较低，质量稳定性较差，需与其他串级质谱联用才能实现多级质谱功能，用于鉴别未知分析物[23]。静电轨道离子阱质谱（Orbitrap MS）是一种基于静电场电磁理论的新型高分辨质量分析器，已经在药物、食品、环境等领域广泛应用。相比Q-TOF MS，该方法能提供更高的质量精度和稳定性，但采集速率较低，在高速扫描时，分辨率会显著下降。常用扫描模式为全扫描/数据依赖性二级扫描（Full MS/ddMS2），即单个分析周期获得精确质量的一级、二级质谱。以已知毒物的精准特征离子质谱信息建立专属数据库，可实现无标准品的非靶向筛查[4,15,17]。Orbitrap MS 的Targeted-SIM 采集模式还有媲美四极杆质谱的定量能力。甘源等[10]以此建立蜂蜜中5 种雷公藤毒素的高分辨质谱定量分析方法。Orbitrap MS 强大的数据库、高质量的质谱图，可轻松实现定性和定量。

4 结语

蜂蜜中毒事件偶发性高、致死率高、危害性强。目前食品安全国家标准仅列举了几种毒性较大的蜜源植物名称，未明确主要毒性成分及其检测方法。植物源毒性物质来源广、种类多、结构复杂，使得植物源毒性成分检测和研究面临巨大的挑战。目前已经发现并建立了上百种物质的鉴定检测方法，但自然界中有毒物质远远不止这些，新的毒性物质亟待去发现和研究。QuEChERs、MCX、MNPs 等高效固相萃取技术在样品预处理中发挥越来越大的作用。QuEChERS 适于大量样品的批量前处理需求，可与多种固相萃取技术灵活结合，提高专属性。MCX 对碱性和中性化合物有很好的选择性，受到了广泛的关注及应用。UPLC-MS/MS 具有痕量的检测灵敏度、准确的定量分析能力，成为植物毒素检测研究和标准制定的重要参考方法。具有强大定性能力和全谱完整信息的UPLC-HRMS 大受青睐。静电轨道阱质谱凭借其精确质量的一级、二级质谱建立的蜂蜜中植物源毒性物质数据库，当蜂蜜中毒事件发生时能实现无标准品非靶向高通量筛查，已成为未知毒物定性检测的利器。上述新方法、新技术的应用亟待建立快速高效、易于操作并且适用范围较广的检测方法，从而提高蜂蜜中植物源毒性分的监管力度，为蜂蜜的安全管理提供技术支持。