高效液相色谱检测葡萄及葡萄酒中7 种有机酸方法的建立
2023-07-09张正文刘兴凯王福成邵学东
沈 燕，张正文，刘兴凯，王福成，邵学东*
（1.君顶酒庄有限公司，山东烟台 265607；2.烟台市蓬莱区葡萄与葡萄酒产业发展服务中心，山东烟台 265699）
有机酸是葡萄果实及葡萄酒中体现风味的主要物质之一，其含量是衡量葡萄果实成熟度和品质的重要参数，在葡萄酒的酿造中发挥着关键作用，对酒的感官质量有一定的影响，与酒的物理化学以及微生物稳定性有着紧密联系[1-4]。酒石酸、苹果酸、柠檬酸和琥珀酸等有机酸普遍存在于葡萄果实以及葡萄酒中，具有各自的特点及功效[4-5]。此外，有机酸含量的高低会直接影响葡萄酒的酸碱平衡与整体的口感风味[6-7]。
近年来，采用高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）测定葡萄及葡萄酒中有机酸的方法有很多，相较于气相色谱、离子色谱以及其他的传统检测方法，HPLC 具有对样品要求低、操作简单、检测时间短、结果准确、重复性好以及可同时检测多种有机酸等优点，应用广泛[8]。液相设备和色谱柱型号不同，检测条件及方法也不尽相同，导致有机酸检测结果有差异。本研究拟用HPLC 法，在前人研究的基础上，对检测条件进行优化，形成一套检测葡萄及葡萄酒中有机酸的完整体系，为葡萄酒企业提供良好的技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
葡萄及葡萄酒样品，君顶酒庄有限公司；纯净水，娃哈哈宏振食品饮料贸易有限公司；浓硫酸（分析纯），山东莱阳经济技术开发区精细化工厂；酒石酸、苹果酸、琥珀酸、柠檬酸、草酸、乳酸和乙酸（标准品），英国政府检测标准集团。
1.2 仪器与设备
1260 Infinity II 高效液相色谱仪；G7114A1260 VWD 检测器；Hi-Plex H 色谱柱（300 mm×7.7 mm，8 μm）；PL Hi-Plex H 保护柱（50 mm×7.7 mm，8 μm），美国Agilent 公司；KQ-500DE 型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；HC-3016R 高速冷冻离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 试样处理
取5 mL 葡萄汁或葡萄酒于离心管中，在14 000 r·min-1、4 ℃下离心20 min，抽取上清液，用0.45 μm 膜过滤，将滤液置于进样小瓶中待测。
1.3.2 标准品处理
有机酸混合标准品配制前，将标准品分别注入仪器中，以确认各有机酸出峰顺序及预计保留时间。混合标准品母液配制：酒石酸4 000 mg·L-1、苹果酸4 060 mg·L-1、柠檬酸4 060 mg·L-1、乳酸4 100 mg·L-1、草 酸2 020 mg·L-1、 琥 珀 酸2 140 mg·L-1、 乙 酸2 100 mg·L-1，按照实验要求稀释到不同浓度梯度备用。
1.3.3 高效液相色谱条件
色谱柱：Hi-Plex H（300 mm×7.7 mm，8 μm）；波长：205 ～215 nm；流动相：0.004 ～0.008 mol·L-1硫酸水溶液；流速：0.4 ～0.8 mL·min-1；柱温箱温度：40 ～60 ℃；有机酸进样量：5 ～15 μL。
2 结果与分析
2.1 HPLC 检测有机酸条件优化
2.1.1 波长的选择
根据马永强等[8]的研究，在波长205 ～215 nm下进行有机酸的检测。结果表明，在210 nm 波长下，7 种有机酸的响应值最高。
2.1.2 流动相的选择
根据色谱柱使用要求及郭燕等[9]的研究，比较0.004 mol·L-1、0.005 mol·L-1、0.006 mol·L-1、0.007 mol·L-1和0.008 mol·L-1的硫酸作为流动相的分离效果。结果表明，低浓度下（0.006 mol·L-1浓度以下），柠檬酸与酒石酸分离效果较差；高浓度下（0.006 mol·L-1浓度以上），整体分离效果都差。因此，选择0.006 mol·L-1的硫酸作流动相。
2.1.3 流速的选择
根 据 丁 玲 等[10]的 研 究， 在0.4 mL·min-1、0.5 mL·min-1、0.6 mL·min-1、0.7 mL·min-1和0.8 mL·min-1流速下检测有机酸。在低流速下，草酸的峰出现了拖尾的现象，且检测时间长，全部出峰所需时间约40 min；在高流速下，柱压过高，可达48 MPa，而色谱柱最高压力要求为50 MPa。因此，确定流速为0.6 mL·min-1。
2.1.4 柱温的选择
根据张军等[11]的研究，选择在柱温为40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃和60 ℃下对有机酸进行检测。当柱温较低时，柠檬酸与酒石酸的分离度过低，随着柱温的升高，二者分离度逐渐增大。60 ℃为Hi-Plex H 色谱柱的最高使用温度，因此为了柱效以及长期检测效果，确定检测柱温为55 ℃。
2.1.5 进样量的选择
根据丁青芝等[12]的研究，选择进样量为5 μL、10 μL、15 μL 检测有机酸，当进样量为5 μL 时，各有机酸的响应值相对较低，当进样量为15 μL 时，柠檬酸与酒石酸的分离度不到1.5。因此，确定进样量为10 μL。
综上所述，HPLC 检测有机酸的最佳色谱条件为紫外检测波长210 nm；流动相0.006 mol·L-1硫酸；流速0.6 mL·min-1；柱温55 ℃；进样量10 μL。
2.2 方法学研究
2.2.1 标准曲线的绘制
根据上述优化得到的色谱条件，将不同浓度梯度的有机酸混合标准品进样，得出7 种有机酸的色谱图，见图1。出峰时间在20 min 内，分离度均大于1.5。用峰面积（y）与质量浓度（x，mg·L-1）绘制7 种有机酸标准曲线，见表1。
表1 有机酸的线性相关性
图1 有机酸标准品的色谱图
由表1 可知，7 种有机酸的峰面积和浓度的相关系数（R2）都在0.999 9 ～1.000 0，说明在相应的浓度范围内线性关系良好；各有机酸的最低检出限在0.031 4 ～0.722 3 mg·L-1（信噪比（S/N≥3），说明该方法的灵敏度较高。
2.2.2 加标回收率
取一葡萄酒样品，添加3 种不同浓度的有机酸标准品，重复检测6 次，结果见表2。各有机酸加标回收率在95.24%～102.04%，相对标准偏差在0.16%～1.87%，表明该方法的准确性良好。
表2 有机酸加标回收率
2.3 HPLC 检测有机酸方法的精密度
2.3.1 有机酸保留时间的重现性
取一葡萄酒样品，重复检测6 次，测定各有机酸的保留时间，结果见表3，各有机酸保留时间的标准偏差在0.005 ～0.073 min，相对标准偏差在0.029%～0.811%，说明在该条件下，有机酸保留时间具有良好的重现性。
表3 有机酸保留时间的重现性
2.3.2 有机酸含量的重现性
取一葡萄酒样品，重复检测6 次，测定各有机酸的平均含量，结果见表4。各有机酸含量的标准偏差在3.024 ～11.430 mg·L-1，相对标准偏差在0.388%～3.426%，表明该方法重现性较好。
表4 有机酸含量的重现性
3 结论
本研究确定了HPLC 检测葡萄以及葡萄酒中草酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸、乳酸和乙酸等7 种有机酸的方法，最佳色谱条件如下。色谱柱为Hi-Plex H；紫外检测波长为210 nm；流动相 为0.006 mol·L-1的 硫 酸；流 速 为0.6 mL·min-1；柱温为55 ℃；进样量为10 μL。该方法样品前处理简便、检测时间短、灵敏度高、精确性及准确性好，适用于葡萄及葡萄酒中有机酸的快速检测。
