UPLC-PDA法同时测定柴胡中3种皂苷的含量

马 莉 ，魏 娟，付 宇

（1. 十堰市人民医院（湖北医药学院附属人民医院） 药学部，湖北 十堰 442000；2. 武当特色中药研究湖北省重点实验室，湖北 十堰 442000；3. 十堰市人民医院（湖北医药学院附属人民医院），湖北 十堰 442000）

柴胡为伞形科植物柴胡（BupleurumchinenseDC.）或狭叶柴胡（BupleurumscorzonerifoliumWilld.）的干燥根[1]。柴胡具有和表解里、升发清阳、疏肝解郁的作用，临床使用较普遍，为治疗少阳证的最佳要药[2]。野生柴胡品种多，生长在中国的柴胡品种共有42类，有17个变种、7种形态[3]。柴胡主要产地是辽宁、河北、山西、河南、甘肃等地；常用于治疗寒热、疟疾、肝郁气滞、胸闷肋痛、脱肛、月经不调、子宫脱垂和直肠前突等疾病[4]。

皂苷类物质是柴胡临床应用时最主要的化学成分[5]，其中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d 含量较高，活性较强[6]。《中国药典》2020年版规定以柴胡皂苷a和柴胡皂苷d作为柴胡中药材的质量评价指标。中药有多成分、多靶点等特点，单一的成分很难全面反映柴胡药材质量，采用多个活性成分进行质量评价更加科学和全面。有研究表明，柴胡中药材中柴胡皂苷c的含量也较高[7]，现代药理研究发现，柴胡皂苷c有抗乙型肝炎病毒（HBV）、抗阿尔茨海默病、抗炎等作用[8-10]，因此将其作为柴胡的指标性成分进行研究，补充完善药典中柴胡药材的质量评价指标。

1 仪器与试药

1.1 仪器

AcquityH CLASS超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；CP214电子分析天平（奥豪斯）；H1650-W微量台式高速离心机（湖南湘仪）；2013QT超声波清洗器（北京碳氢）。

1.2 试药

柴胡皂苷a，c，d对照品（批号：wkp2020020703，wkp2020042905，wkp2020021001，纯度≥98 %，四川维克奇）；柴胡药材（批号：20190301， 20190302，20190303，产地湖北，湖北神农本草中药饮片有限公司），经湖北医药学院张晓燕教授鉴定为正品；乙腈为色谱纯，甲醇、浓氨试液为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

乙腈为流动相A，水为流动相B，梯度洗脱：0～18 min，25 %～90 %A；18～20 min ，90 %～90 %A；柱温30 ℃；流速0.3 ml/min；于200 nm波长下测定柴胡皂苷a，c，d的含量，进样量：5 μl。

2.2 供试品溶液的制备

将柴胡药材粉碎，过四号药筛，取样品细粉约0.5 g，精确称量，置入于具塞锥形瓶，精确加入含5 %浓氨试液的甲醇25 ml ，密塞瓶口，30 min超声处理（功率200 W，频率40 kHz，水温30 ℃），过滤后分两次加入20 ml甲醇，洗涤药品残渣和容器，合并滤液和洗涤液，置入旋转蒸发器，60 ℃加热溶剂回收至干后，甲醇溶液溶解残渣，转移至5 ml量瓶，定容，摇匀，再次过滤，取滤液[1]。

2.3 混合对照品溶液的制备

取柴胡皂苷a，c，d对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制成混合对照品溶液，使每1 ml含柴胡皂苷a，c，d分别为1.3，1.3，1.46 mg，摇匀，低温避光保存备用。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性试验 取混合对照品溶液、供试品溶液进样分析，得样品的UPLC色谱图。参照3个对照品的色谱行为及其PAD紫外检测光谱图，标定了3个成分，分别是柴胡皂苷a、柴胡皂苷c和柴胡皂苷d（见图2）。

图1 UPLC色谱图

2.4.2 线性关系考察 取2.3项下混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件，分别进样0.5，2，3.5，5，6.5 μl，以柴胡皂苷a、柴胡皂苷c和柴胡皂苷d的进样量X（μg）为横坐标，色谱峰面积Y为纵坐标进行线性回归，各成分回归方程见表2。结果表明，柴胡皂苷a、柴胡皂苷c和柴胡皂苷d分别在进样量为0.65～8.45，0.65～8.45，0.73～9.49 μg范围内与峰面积线性关系良好。

表2 3种成分线性关系考察试验数据

2.4.3 精密度试验 精密吸取2.3项下混合对照品溶液，连续进样6次，记录峰面积。结果表明，柴胡皂苷a，c，d峰面积的RSD分别为0.33 %，0.46 %和1.29 %，表明仪器精密度良好。

2.4.4 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，12，24 h，按2.1项下色谱条件测定，结果表明，柴胡皂苷a，c，d峰面积的RSD分别为1.66 %，0.85 %和1.42 %，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.5 重复性试验 取同一批药材粉末，按2.2方法项制备供试品溶液6份，按2.1项色谱条件测定含量，得柴胡皂苷a，c，d的平均含量为3.08，1.37，2.53 mg/ml，RSD值分别为1.31 %，2.17 %和2.58 %，表明此法重复性良好。

2.4.6 加样回收率试验 精密称取同一批柴胡样品6份，已知样品中柴胡皂苷a，c，d的含量，分别精密混合对照品溶液1 ml，按2.2项方法制备供试品溶液，按2.1项色谱条件进样，结果见表3。

表3 柴胡中3种成分的加样回收率试验结果（n=6）

2.5 样品含量测定

精密称取3批柴胡样品，按2.2项方法制备供试品溶液，按2.1项色谱条件进样测定3种成分的含量，结果见表4。

表4 3种成分含量测定结果/mg·g-1（n=3）

3 讨论

3.1 提取方式的选择

柴胡皂苷对热不稳定[6]，因此采用30 ℃温水超声提取。考察5 %氨水甲醇、100 %甲醇和100 %乙腈等不同提取溶剂，结果表明，5 %氨水甲醇提取效果较好，因此采用5 %氨水甲醇溶液为提取溶剂。

3.2 波长的选择

用PDA检测器对样品于190～400 nm进行全波长扫描，结果表明，柴胡皂苷a，c，d在200 nm波长下能同时出现且有最大吸收，故选择于200 nm波长同时测定3种成分的含量。

3.3 流动相的选择

依次考察了乙腈-水、乙腈-冰醋酸、乙腈-磷酸为流动相时色谱峰的分离效果。结果表明，以乙腈-水为流动相时色谱峰的分离度及峰形较好，且所测成分含量相对较高，这也与文献报道的柴胡皂苷a、d在酸性条件下易开环分解相符[11]，故最终选择乙腈-水进行梯度洗脱。

3.4 UPLC与HPLC色谱法对比

有研究采用HPLC测定3种柴胡皂苷的含量，检测时间较长，进行1次进样分析通常需30～60 min，且流动相消耗量较大[12-13]。本研究采用UPLC可在20 min内可完成1 次色谱分析，且有更好的分离度、灵敏度和更快的分离速度，单位时间内能提供更多的信息量，同时更节省流动相。

本研究采用UPLC法同时测定柴胡中药材中3种活性成分的含量，避免了单一活性成分测定带来的繁琐步骤，减少了流动相配制和供试品制备步骤，有效提高了分析速度，缩短分析周期。此法简便、快捷、准确，可为柴胡中药材的质量评价提供参考。