鸡传染性支气管炎病毒抗体间接ELISA检测方法的建立与初步应用
2023-07-07郭梦娇张成成薄宗义楚电峰曹永忠吴艳涛张小荣
赵 佳,郭梦娇,,张成成,薄宗义,楚电峰,曹永忠,吴艳涛,,张小荣,*
(1.扬州大学 兽医学院 江苏省动物重要疫病预防控制协同创新中心,江苏 扬州 225009;2.动物基因工程疫苗国家重点实验室,山东 青岛 266114;3.扬州大学 农业科技发展研究院教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室,江苏 扬州 225009)
鸡传染性支气管炎(infectious bronchitis,IB)是由传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)引起鸡的急性、高度接触性传染病[1],临床上主要以呼吸道损伤和间质性肾炎,母鸡早期感染后呈现生殖系统不可逆的损伤,形成所谓的“假母鸡”[2]。我国目前同时存在多个基因型IBV流行,并且新的型还在不断出现[3-5],使得IB的流行情况日益复杂。
ELISA广泛用于各种病原微生物感染的监测,具有成本低、易于操作以及能对群体进行诊断的优势。对于IB而言,疫苗免疫和野毒感染后的抗体应答水平存在较大差异,野毒感染产生的抗体水平通常要远远高于疫苗免疫。针对特定的养殖场,在免疫程序相对固定的情况下,鸡群免疫后不同时间点的抗体“基线”水平基本一致,如果在监测中发现某个时间点出现抗体水平异常升高且离散度增大的情况,一般即可判定该鸡群可能发生了野毒感染。
N蛋白是构成IBV病毒粒子最主要的结构蛋白,在不同血清型的IBV中相对比较保守,在IBV感染后,机体产生针对N蛋白的特异性抗体相对于其他结构蛋白出现时间更早[6],对于监测野毒的早期感染具有重要意义。本试验旨在以大肠杆菌原核表达的IBV N蛋白作为包被抗原,建立一种在固定血清稀释倍数下对IBV抗体终点滴度进行定量检测的间接ELISA方法,可应用于临床IBV感染监测。
1 材料与方法
1.1 材料表达IBV N蛋白的菌株BL21(DE3)/pET-N、QX型IBV弱毒疫苗株QXL87和强毒株QXL均由本实验室保存[7];SPF鸡购自济南斯派福瑞禽业科技有限公司;SPF鸡胚购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司;不同时间采集的商品鸡血清样品由江苏康瑞生态农业有限公司提供;SPF鸡血清由国药集团扬州威克生物工程有限公司提供;新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、H5、H7、H9亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)阳性血清由青岛易邦生物工程有限公司提供;鸡毒支原体(Mycoplasmagallisepticum,MG)、滑液囊支原体(Mycoplasmasynoviae,MS)、副鸡禽杆菌(Avibacteriumparagallinarum,Apg)阳性血清由本实验室制备并保存。
1.2 主要试剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)购自上海生工生物工程有限公司;Ni-NTA亲和层析介质购自南京金斯瑞生物科技有限公司;IBV抗体检测试剂盒购自IDEXX公司;脱脂奶粉购自Biofroxx公司;牛血清白蛋白(BSA)购自上海双洳生物有限公司;鱼明胶、Tween-20购自Sigma公司;辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗鸡IgG购自Thermo Fisher公司;TMB双组分显色液购自北京索莱宝生物科技有限公司。
1.3 IBV N蛋白的表达与纯化按照文献[7]方法对IBV的N蛋白进行原核表达并使用Ni-NTA亲和层析法纯化,通过SDS-PAGE鉴定纯化效果,使用Image J软件进行灰度分析。
1.4 阴、阳性血清的制备及效价测定16只25日龄的SPF鸡饲养于负压隔离器,免疫前翅静脉采血分离血清,作为阴性对照血清。首次免疫用QXL87弱毒疫苗株进行滴鼻,之后每隔2周用QXL强毒株经滴鼻途径攻毒,剂量均为105.0EID50/0.1 mL,第3次攻毒1周后,通过病毒微量中和试验测定血清效价[8],效价达标后(NI50达到4.50～7.00)心脏采血,分离血清作为阳性对照血清。
1.5 ELISA技术参数的优化
1.5.1抗原包被浓度及血清稀释倍数的确定 通过棋盘滴定法[9]确定抗原的最佳包被浓度及血清样品的稀释倍数,用碳酸盐缓冲液(pH=9.60)将纯化的重组蛋白的质量浓度从4.000 g/L倍比稀释至3.125×10-2g/L,将IBV阴性、阳性血清分别进行1∶125～1∶4 000倍比稀释,进行间接ELISA,读取D450 nm值,通过P/N值来确定抗原最佳包被浓度与血清最佳稀释倍数。
1.5.2酶标板封闭条件的确定 分别以质量分数为1.00% BSA-PBST、1.00% 鱼明胶-PBST及5.00% 脱脂奶粉-PBST作为封闭液,并设置2,3和4 h的封闭时间,设置3个重复,进行间接ELISA,读取D450 nm值,通过P/N值确定最佳封闭条件。
1.5.3抗体稀释液的选择 分别以PBST、质量分数为0.25%,0.50%和1.00% BSA-PBST作为抗体稀释液,设置3个重复,进行间接ELISA,读取D450 nm值,通过P/N值确定最佳抗体稀释液。
1.5.4血清样品孵育时间的确定 分别设置30,60和90 min作为血清样品稀释后的孵育时间,设置3个重复,进行间接ELISA,读取D450 nm值,通过P/N值确定血清样品的孵育时间。
1.5.5酶标抗体工作条件的确定 分别对酶标抗体进行1∶5 000,1∶10 000,1∶15 000,1∶20 000倍稀释,设置30,60和90 min的孵育时间,设置3个重复,进行间接ELISA,读取D450 nm值,通过P/N值确定酶标抗体的最佳反应条件。
1.5.6显色时间的确定 分别设置10,15和20 min 3个显色时间,设置3个重复,进行间接ELISA,读取D450 nm值,通过P/N值确定TMB最佳显色时间。
1.5.8特异性试验 分别以IBV、AIV(H5、H7、H9)、NDV、MS、MG、Apg的单因子阳性血清及SPF鸡血清作为测试样品,每份血清设置3个重复,进行间接ELISA,以检测该方法的特异性。
统计血清样品在不同稀释倍数下的D450 nm平均值,与PNT基线交点的最大稀释倍数定义为该血清样品的抗体ET。从中选取12份低滴度(ET ≤ 1 000)、19份中滴度(1 000
表1 Y03与Y04鸡群免疫程序
2 结果
2.1 IBV N蛋白的表达与纯化对IBV N蛋白进行了原核表达和纯化,通过SDS-PAGE分析蛋白纯化情况,与文献[7]描述的纯化结果相符,灰度分析显示重组蛋白的纯度达到86.37%,定量分装后-70℃ 保存备用。
2.2 阳性血清的制备及效价测定经病毒微量中和试验测定,制备的阳性血清中和抗体效价为:NI50=11.80。
2.3 ELISA技术参数的确定经过条件优化,通过P/N最大值确定了最佳反应条件,最终确定抗原包被质量浓度为0.50 g/L,4℃包被过夜,次日弃去孔中液体,PBST洗涤4次并拍干;用质量分数为5.00% 的脱脂奶粉-PBST在37℃条件下封闭2 h,弃去孔中液体,PBST洗涤4次并拍干;用质量分数为0.50%的BSA-PBST抗体稀释液对血清样品进行1∶500倍稀释后37℃孵育30 min,弃去孔中液体,PBST洗涤4次并拍干;酶标抗体进行1∶5 000倍稀释后37℃孵育30 min,弃去孔中液体,PBST洗涤4次并拍干;TMB避光显色20 min,加入浓度为2 mol/L浓硫酸终止显色,立刻读取D450 nm值。
2.5 特异性试验对IBV、NDV、AIV(H5、H7、H9)、MS、MG、Apg单因子阳性血清及SPF血清进行间接ELISA检测,除IBV阳性血清外,其他血清的S/P值均低于临界值0.385,说明建立的方法与其他阳性血清无交叉反应,具有良好的特异性。
2.6 重复性试验批内和批间重复性试验结果见表2,批内变异系数为0.740%～2.850%,批间变异系数为4.382%～6.769%。变异系数均低于10.000%,说明具有较好的重复性。
2.7 计算IBV抗体ET方程的建立选取50份通过PNT基线确定了抗体ET的血清样品,通过软件分析得出血清1∶500稀释倍数处S/P值与抗体ET的线性回归方程:log(ET)= 1.222 × log(S/P)+3.285,结果见图1,相关系数(R2)达到0.959 3(P<0.000 1)。
2.8 符合性试验
2.8.1阴、阳性符合率验证 检测了2个鸡群共461份不同日龄商品鸡的血清样品,统计2种ELISA方法的检测结果,如表3所示,与IDEXX试剂盒相比,IBVN-ELISA方法的总体样品检测符合率为93.06%,阳性检测符合率为98.45%,阴性检测符合率为64.86%。IDEXX试剂盒检测为阴性,IBVN-ELISA检测为阳性的26份血清均在14,21和28日龄,PNT基线法测定的结果均为IBV抗体阳性,滴度范围为1 000～4 000。
表2 批内和批间重复性结果
图1 ET与S/P值(1∶500稀释倍数处)的线性回归方程
表3 阴性、阳性符合率验证
2.8.2抗体ET的消涨趋势比较 分别计算在不同日龄时Y03和Y04 2个鸡群的平均抗体ET并绘制折线图,如图2所示,2种ELISA方法检测的抗体ET消涨趋势保持一致。
2.8.3抗体ET分布情况比较 统计2种ELISA方法测得的阴、阳性血清的抗体ET,并绘制抗体ET分布散点图,如图3所示,IBVN-ELISA方法与IDEXX试剂盒测试的抗体ET分布情况基本相似。
2.8.4敏感性与特异性比较 通过ROC曲线分析2种ELISA方法的敏感性和特异性,如图4所示,曲线下面积(AUC)为0.999 6,IBVN-ELISA方法的特异性达到100.00%,敏感性达到99.75%(P<0.000 1),与IDEXX试剂盒的检测结果高度一致。
A.Y03鸡群抗体ET消涨趋势;B.Y04鸡群抗体ET消涨趋势
A.IDEXX-ELISA抗体ET分布图;B.IBVN-ELISA抗体ET分布图
A.IDEXX-ELISA敏感性与特异性分析;B.IBVN-ELISA敏感性与特异性分析
3 讨论
我国是家禽养殖和消费大国,肉鸡和蛋鸡养殖规模增长迅速,鸡群进行疫苗接种依然是防控IB最有效的措施,然而IBV极易发生重组和突变[11],变异毒株经常在接种疫苗的鸡群中暴发感染,导致免疫失败。因此越早地监测到野毒传播,就可以尽快采取措施,及时降低经济损失。尤其对于蛋鸡而言,及早发现野毒感染,能减小“假母鸡”带来的负面影响。目前国内使用的IBV抗体检测ELISA试剂盒基本都是进口产品,价格比较昂贵,检测成本较高。大多数市售的ELISA试剂盒以IBV全病毒作为包被抗原[12],由于IBV的高度易变性, 包被全病毒抗原的试剂盒对于不同血清型野毒感染产生的抗体水平,测定结果可能存在一定的差异。但是不同血清型IBV的N蛋白较为保守,具有良好的免疫原性,针对不同血清型IBV感染后的抗体检测结果更加稳定[13]。
本研究以原核表达的IBV N蛋白作为包被抗原,建立了检测IBV抗体ET的ELISA方法。批内和批间变异系数均小于10.00%,具有良好的重复性;包被抗原与常见病原的阳性血清无交叉反应,具有较好的特异性;使用IDEXX试剂盒与本研究建立的IBVN-ELISA对2个不同品种鸡群每隔1周进行连续抗体监测,结果表明2种方法检测抗体ET的消涨趋势保持一致,抗体ET的分布情况基本吻合;IBVN-ELISA的阳性符合率达到98.45%,阴性符合率为64.86%,其中26份IDEXX试剂盒检测为阴性,IBVN-ELISA检测为阳性的血清样品均在14,21和28日龄,PNT基线法测定的结果均为IBV抗体阳性,与IBVN-ELISA的检测结果一致,表明IBVN-ELISA能够更灵敏的检测到IBV特异性抗体;从方法的敏感性和特异性来看,IBVN-ELISA具有较高的特异性(100.00%)和敏感性(99.75%),且敏感性略高于IDEXX试剂盒。
不同的免疫程序及鸡群品种的不同是IBV抗体ET及其消涨趋势存在差异的主要原因[14]。此次监测了2个免疫程序相同但品种不同的鸡群,结果表明:2个鸡群的抗体ET值及其消涨趋势并不完全相同,1日龄时2个鸡群均以母源抗体为主,抗体ET最高,之后不断下降。Y03鸡群的抗体ET在21日龄时开始升高,在35日龄时达到峰值;而Y04鸡群的抗体ET在14日龄时开始上升,ET峰值出现在42日龄。通过IBVN-ELISA监测不同品种鸡群抗体ET及其消涨的规律并建立其抗体ET的基线在后续的研究计划中将是很有意义的工作。
综上所述,本研究建立的ELISA方法研制成本较低,稳定性良好,特异性及灵敏度较高,有着较好的检测效果,能够为养殖场在鸡群抗体监测过程中发挥有效的检测效力,为有效防控IB提供了技术支撑,具有良好的应用前景。
