行星保护任务中干热灭菌生物指示剂应用及筛选分析

党 磊，邹乐洋，袁俊霞，宋 研，杨金禄，徐侃彦，印 红

（1.航天神舟生物科技集团有限公司；2.北京空间飞行器总体设计部：北京 100086）

0 引言

1984 年，国际空间研究委员会（Committee for Space Research, COSPAR）根据深空探测任务的目标和类型不同，对行星保护任务进行分类，并对一些探测任务提出具体的微生物控制要求。为了使深空探测航天器满足对各类任务的生物负载要求，需在航天器研制各阶段进行微生物控制。包括我国在内的多个国家对多种航天器的AIT（装配、集成和测试）环境微生物状况的分析已证明，AIT 环境中的优势微生物以产芽孢菌为主，占细菌总量的50%～60%[1]；同时，芽孢作为产芽孢菌在恶劣环境中的特殊存在形式——休眠体，对高温、干燥、辐射等环境具有很强的抵抗能力。因此，芽孢是行星保护任务中须重点关注的微生物形态[2]，是航天器微生物灭菌的主要对象。

目前航天器常用的灭菌技术包括干热灭菌（dry heat microbial reduction, DHMR）、气相过氧化氢灭菌（vaporized hydrogen peroxide, VHP）、辐射灭菌和红外线灭菌等[3-6]。其中干热灭菌技术因其灭菌效果好、材料兼容性广、灭菌后无残留等优点，成为NASA、ESA 在行星保护任务中批准使用的灭菌技术。NASA、ESA 分别在文件NPR 8020.12D[7]和ESCC-Q-ST-70-57C[8]中对应用于行星保护任务的干热灭菌技术流程提出了规范性要求。

耐热芽孢杆菌是干热灭菌技术常用的生物指示剂，用于对灭菌程序的灭菌效率进行监测。为满足行星保护任务的微生物控制要求，NASA 在干热灭菌生物指示剂方面做了大量的基础研究。本文综述NASA 行星保护任务中干热灭菌的生物指示剂研究现状，介绍NASA 根据生物指示剂选取的变化对干热灭菌技术流程规范的修订，并结合我国AIT环境的微生物状况分析，对适用于我国行星保护任务的干热灭菌生物指示剂筛选流程提出建议，为在航天器AIT 环境下实施干热灭菌技术提供支持。

1 生物指示剂在灭菌过程中的应用

生物指示剂是一类特殊的微生物制品，对特定的灭菌程序有明确和稳定的耐受性[7]，可用来验证灭菌过程和程序是否符合要求。不同灭菌方式使用不同的生物指示剂，如干热灭菌使用B.atrophaeusATCC 9372；湿热灭菌和过氧化氢气相灭菌使用G.stearothermophilusATCC 7953、B.atrophaeusATCC 9372 和C.sporogenesATCC 7955；环氧乙烷灭菌使用B.atrophaeusATCC 9372；辐射灭菌使用B.pumilusATCC 27142 等[9-12]。D值是指灭菌过程中杀灭90%的作为生物指示剂的微生物所需的时间，是微生物对暴露环境损伤抵抗力强弱最直接的表征，也是生物指示剂在灭菌技术应用时的重要参考指标。无论使用哪种灭菌方式，都需用已知D值的生物指示剂进行灭菌工艺的验证。任何一种生物指示剂的建立和选用均需有稳定、可靠的 D 值作为参考。影响生物指示剂D值的因素较多，包括在制备阶段的各种营养成分，在应用阶段所处环境的温度等。在常规微生物实验中，上述各种灭菌方式使用的生物指示剂及其D值如表1 所示[13-14]。针对干热灭菌方式，在20 世纪20 年代研究人员已开始研究芽孢的致死问题，检测耐热菌在不同温度下的D值，NASA 制定干热灭菌技术流程规范也得益于几十年前的研究结果[15-16]。

表1 不同灭菌方式的生物指示剂D 值[13-14]Table 1 D values of biological indicators of diffident sterilization methods[13-14]

2 NASA 干热灭菌生物指示剂

用作生物指示剂的菌株的基本筛选要求包括[10,12]：1）在需灭菌产品中所有可能的污染菌中耐受能力最强；2）无致病性；3）稳定，存活期长，易于保存；4）易于培养；5）使用芽孢的生物指示剂中芽孢含量在90%以上。NASA 在筛选干热灭菌生物指示剂时也遵从了上述要求。由于B.atrophaeusATCC 9372 芽孢无致病性，无热源且无毒，对干热的耐受能力强于大多数微生物，所以早在干热灭菌研究初期就被选作生物指示菌株。NASA 喷气推进实验室（JPL）使用的干热灭菌生物指示剂为产芽孢菌的芽孢体，如B.atrophaeusATCC 9372 和B.canaveraliusATCC 29669[5-6]。对干热的耐受性并非对生物指示菌株的唯一要求，NASA 曾在“海盗号”任务期间分离到1 株编号V5-8 的产芽孢菌株和B.xerothermoduransATCC 27380 菌株，虽然这2 株菌都具有极强的耐热能力，但由于其芽孢本身的生物特性，如芽孢体易聚集结块、生长特别缓慢、成芽孢率较低，不能作为干热灭菌生物指示剂使用[17-19]。B.atrophaeusATCC 9372 和B.canaveraliusATCC 29669 菌株在NASA 关于干热灭菌技术的研究中占据重要位置，影响了NASA 应用于行星保护任务的干热灭菌技术流程规范的制定和修改。

2.1 B. atrophaeus ATCC 9372

B.atrophaeusATCC 9372 是一种重要的生物指示剂菌株，美国、英国、日本、欧盟等国家和地区都将该菌株作为干热灭菌、湿热灭菌和环氧乙烷灭菌等灭菌方式的通用生物指示剂[20]。同时，该菌株还作为质控标准菌株被列入食品和医疗的检测标准中。

B.atrophaeusATCC 9372 是一种革兰氏阳性需氧菌，菌落在含有有机氮的培养基上呈现褐色或者棕红色，在文献中常被称为枯草芽孢杆菌黑色变种（B.subtilis var.niger）[21]。由于B.atrophaeusATCC 9372 营养体菌落有颜色，容易从非产色素细胞中被分离出来，且是AIT 环境中常见的微生物，早在“海盗号”探测器研制时期就被NASA 用作干热灭菌的生物指示剂[22-24]。

NASA 对B.atrophaeusATCC 9372 在104～125 ℃范围内的杀灭情况进行了研究，并在其规范文件NPR 8020.12D 中将B.atrophaeusATCC 9372降低2～3 个数量级作为干热灭菌的杀灭效果验证。目前，B.atrophaeusATCC 9372 的耐干热机制尚不明确，可能与芽孢内吡啶二羧酸（pyridine-2,6-decarboxylic, DPA）以及核心结构矿物质含量有关[25]；还有研究显示，α/β 酸溶性小蛋白（SASPs）与DNA 结合也可以提高芽孢对干热损伤的抵抗能力[23]。

Kempf 等 研 究B.atrophaeusATCC 9372 在115～170 ℃温度条件下的杀灭情况，发现该菌株在125 ℃时的D值为19.7 min[26]。而JPL 对从Mariner-Mars 1969 项 目 的 航 天 器AIT 环 境 中 收 集 到 的103 个菌株的芽孢进行分析发现，这些菌株的芽孢在125 ℃时的D值在5～58 min 之间，虽然平均D值（18.8 min）与B.atrophaeusATCC 9372 的D值接近，但该研究结果同时表明，AIT 环境中存在比B.atrophaeusATCC 9372 更耐热的菌株[27]。Haque 等对在聚四氟乙烯带上收集的237 种耐热菌进行高通量干热筛选发现，大多数受试菌株比B.atrophaeusATCC 9372 更耐干热[22]。综上，航天器AIT 环境中存在很多D值高于B.atrophaeusATCC 9372 的菌株，因此，出于行星保护的考虑，再以B.atrophaeusATCC 9372 为干热灭菌生物指示剂已不能满足任务要求。

2.2 B. canaveralius ATCC 29669

B.canaveraliusATCC 29669 是从“海盗号”探测器组装洁净室的空气沉降菌中分离得到的，是目前已知最耐热的产芽孢菌株之一[28-30]。Schubert 和Beaudet 将B.canaveraliusATCC 29669 芽 孢 暴 露在125～200 ℃的环境中，检测其在该温度范围内的D值，并与B.atrophaeusATCC 9372 对比。结果显示B.canaveraliusATCC 29669 在115 ℃、125 ℃、200 ℃时的D值分别是B.atrophaeusATCC 9372的80 倍、30 倍和5 倍[31]。B.canaveraliusATCC 29669 的耐热机制尚不确切，但Seuylemezian 等通过对“海盗号”装配过程中分离到的12 株耐热芽孢杆菌进行基因序列比对发现，B.canaveraliusATCC 29669 的基因组中包含1 个编码来自Thermococcus kodakaraensis的糖原分支酶的基因，可能有助于菌株耐热性的提高[32]。

将B.canaveraliusATCC 29669 的16S rRNA基因序列与JPL 收集的来自肯尼迪航天中心航天器装配车间、约翰逊航天中心以及“凤凰号”航天器组装车间的近6100 个菌株的基因序列进行比对[32-37]，发现只有10 个相似序列（相似度大于97.5%的序列称为相似序列）。虽然B.canaveraliusATCC 29669 在航天器装配环境中并不多见，但由于其具有很强的耐热性，出于深空探测行星保护的考虑，NASA 将其作为干热灭菌的指示菌株，在≥125 ℃条件下实现对微生物4～6 个数量级的杀灭。NASA 比较分析了该菌株在110～200 ℃范围内的杀灭情况，结果显示该菌株在各温度条件下的D值 均 大 于B.atrophaeusATCC 9372 的[26,31]。因此，NASA 于2013 年修改了文件NPR 8020.12D 中的干热灭菌技术流程规范，将干热灭菌温度从原来的104～125 ℃更改为110～200 ℃，并给出了使航天器达到无菌水平的干热灭菌操作建议——500 ℃下保持0.5 s。

使用红外加热技术将B.canaveraliusATCC 29669 菌株迅速升温至200 ℃以上，根据其存活率结果以及数据模型分析显示，初始生物负荷为1×106CFU 的B.canaveralius ATCC 29669 芽 孢，在292 ℃下保持0.5 s 后即可达到10-6CFU 的无菌保证水平（sterility assurance level, SAL）[6]。为提高检测敏感性，加热处理后，直接将接种芽孢的材料放入培养基中进行摇瓶培养，在268～334.2 ℃均未检测到芽孢生长。根据以上研究结果，NASA将干热对芽孢的杀灭提高到了6 个数量级，并认为292 ℃即可达到无菌水平，目前的规范可能存在过度灭菌的问题。

3 我国干热灭菌生物指示剂

3.1 AIT 环境中耐热微生物的分离

以笔者所在航天生物公司空间微生物实验室从海南AIT 环境获取的某批次微生物检测结果为例，B.amyloliquefaciens及其近缘类群B.licheniformis是最常检出的产芽孢类微生物，占所有检出产芽孢菌的60%。对北京AIT 环境中的嗜热微生物分离检测发现，能够耐受65 ℃高温的139 株产芽孢菌主要来自于芽孢杆菌属（Bacillus）、地芽孢杆菌属（Geobacillus）和好氧芽孢杆菌属（Aeribacillus）等，如图1 所示。

图1 北京AIT 环境中耐热菌组成Fig.1 Composition of heat-resistant microorganisms in Beijing AIT environment

以其中1 株B.amyloliquefaciensB30175 为例，其在115 ℃、125 ℃、135 ℃温度下的D值均高于B.atrophaeusATCC 9372 的，说明该菌株的耐热能力强于B.atrophaeusATCC 9372（见表2[24]）。随着杀灭微生物数量级的增加，两者的差距更加明显，如在115 ℃时杀灭6 个数量级，B.atrophaeusATCC 9372 只需72.0 min，而B.amyloliquefacienB30175需447.8 min。

表2 B. amyloliquefaciens B30175 和 B. atrophaeus ATCC 9372 杀灭不同数量级微生物所需时间对比[24]Table 2 Comparison of time required for killing different logarithmic values between B. amyloliquefaciens B30175 and B. atrophaeus ATCC 9372[24]

B.amyloliquefacienB30175 只是目前筛选到的耐热菌株之一，笔者实验室对其他耐热菌株的研究还在进行，不排除我国AIT 环境中也存在类似B.canaveraliusATCC 29669 的具有极强耐干热能力菌株的可能性。针对我国AIT 环境中的耐热菌株组成，目前正在研究它们在110～200 ℃范围内的杀灭时间和杀灭效率的关系，并最终以杀灭6 个数量级为目标，建立我国AIT 环境的耐热微生物菌株数据库，用于航天器干热灭菌生物指示剂的筛选。

3.2 干热灭菌生物指示剂的筛选

目前我国在行星保护任务的灭菌研究中，还没有单独应用的生物指示剂，仍使用NASA 干热灭菌常用的B.atrophaeusATCC 9372，存在灭菌不完全的风险，因此亟需根据我国航天器AIT 环境微生物状况筛选合适的干热灭菌生物指示剂。筛选可按照图2 所示流程进行：首先对AIT 环境中已分离出的耐热产芽孢菌进行菌株鉴定，确定菌株种类，确保菌株无致病性；再从中选择易培养、成芽孢率高的菌株；以这些菌株为干热灭菌研究对象，以125 ℃时的D值为检测指标进行普筛，再对其中的优异耐热菌株进行110～200 ℃范围内的芽孢杀灭效率检测，明确这些菌株在各温度下的D值，以便遴选作为航天器干热灭菌的生物指示剂。

图2 干热灭菌生物指示剂筛选流程Fig.2 Screening process of biological indicators for DHMR

需要明确的是，对干热灭菌生物指示剂的筛选是长期不间断的动态过程，随着耐热能力更强菌株的不断被发现，不同时期可能会使用不同的生物指示剂。

4 结束语

干热灭菌是所有灭菌方法中最有效、最可控、综合效果最好的穿透性灭菌方式。干热灭菌生物指示剂的使用为干热灭菌技术流程规范的形成提供了重要参考依据。随着在AIT 环境中采集和分离的生物指示剂菌株的耐热能力不同，NASA 逐步修改了其灭菌技术流程规范。

当前，我国的干热灭菌主要参考NASA 的标准和规范，对干热灭菌生物指示剂的研究还处于初始阶段。未来可以在NASA 现有研究的基础上，继续对深空探测航天器装配过程的各阶段进行环境微生物采样，特别是对制造、装配过程已经过高温处理的航天器进行采样，筛选耐热芽孢菌株，找到适合我国航天器干热灭菌的生物指示剂，为制定适合我国的航天器干热灭菌技术流程规范提供数据支持，最终目标是保证航天器的微生物控制既满足行星保护任务要求，又能避免过度灭菌对航天器仪器设备表面造成不必要的损伤。