尿石素A通过TLR4/NF-κB信号通路对重症急性胰腺炎的保护作用及机制

曾家月，马昕玥，马凤雨，陈霞，2△

重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是一种临床常见的重症急腹症，病情凶险，致残率及致死率高，给患者和社会造成了巨大的医疗负担及经济负担［1-2］。据统计，2016 年全球急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）的发病率约为34/10 万人，其中SAP 占AP 总数的2.4%～12%，病死率高达30%［3-4］。大量炎性细胞因子释放在SAP 早期的发展中发挥重要作用。早期抑制炎症级联反应，阻止病情进展，可有效降低SAP 病死率。Toll 样受体4（TLR4）/核转录因子（NF）-κB 通路是经典的炎症反应信号通路，在SAP 早期阻断该通路可延缓病情进展，改善预后［5］。尿石素A（urolithin A，UroA）是鞣花酸经肠道微生物代谢后的主要活性物质，具有抗炎、抗氧化、抗衰老等多种生物学作用，对缺血/再灌注微血管损伤［6］、结肠炎［7］等疾病有明显改善作用。目前，UroA对炎症反应的抑制作用受到越来越多的关注，但其能否抑制SAP的炎症反应，从而改善SAP胰腺病理损伤尚鲜见相关报道。本研究通过建立SAP大鼠模型，探索UroA 对SAP 大鼠胰腺损伤的影响，并基于炎症反应和炎症信号通路探讨其可能机制，以期为SAP治疗提供新的候选药物。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康成年SPF 级雄性SD 大鼠36 只，体质量200～250 g，购自西南医科大学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK（川）2018-17。所有大鼠均饲养于SPF级动物房，室内温度维持在（22±2）℃，相对湿度40%～70%，模拟昼夜交替规律，每日更换饮用水、颗粒饲料。

1.1.2 主要试剂与仪器 UroA、羟甲基纤维素钠（CMC-Na）均购自美国Selleck 公司；牛磺胆酸钠化合物（上海西格玛奥德里奇贸易有限公司）；鼠源抗MyD88 抗体（英国Abcam 公司）；兔源抗NF-κB p65抗体（美国cell signaling technology 公司）；鼠源抗TLR4、β-actin 抗体（圣克鲁斯生物技术有限公司）；二甲基亚砜（DMSO）、辣根过氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）标记的山羊抗鼠IgG 抗体、山羊抗兔IgG 抗体（上海碧云天生物技术有限公司）；白细胞介素（IL）-6、肿瘤坏死因子（TNF）-α 酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（武汉科鹿生物科技有限责任公司）；ECL发光液（重庆葆光生物技术有限公司）、脂肪酶（LPS）测定试剂盒（微板法）购自南京建成生物工程研究所；所有引物均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；动物组织总RNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）；ReverTra Ace®qPCR RT Master Mix、荧光定量PCR 试剂盒（上海东洋纺生物科技有限公司）。NanoDrop-2000 分光光度计（美国Thermo 公司）；实时荧光定量PCR 仪StepOnePlus（美国Applied Biosystems 公司）；多功能酶标仪（德国BMGLABTECH 公司）；荧光正置显微镜BX43（日本Olympus 公司）；化学发光成像仪Fusion solo4（法国VILBER公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 动物造模及分组 36 只SD 大鼠适应性饲养1 周后，按照随机数字表法分为假手术组（Sham 组）、SAP 组和UroA组，每组12只。禁食不禁水12 h后，参照文献［8］的方法，大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉，在上腹部正中作一切口，暴露胰胆管，血管夹夹闭肝门部胰胆管，经十二指肠刺入胰胆管，夹闭胆总管末端，注射5%牛磺胆酸钠溶液（1 mL/kg）建立SAP模型。注射10～20 min后观察到胰管走行区域的胰腺组织出现充血、水肿，且随着时间延长红肿面积逐渐扩大，表明SAP模型制作成功，即可逐层缝合并关闭腹腔。Sham组开腹后仅翻动肠管后关闭腹腔。术后于大鼠背部皮下注射生理盐水（20 mL/kg）补充术中液体丢失。用DMSO 将UroA 粉末溶解成母液后置于-80 ℃冰箱保存，CMC-Na 稀释母液制成UroA 工作液。UroA 组大鼠于术后苏醒时灌胃UroA 溶液（10 mg/kg），每6 h灌胃给药1次，共4次；SAP组与Sham组灌胃等量CMC-Na溶剂。造模24 h后，心脏穿刺采血后处死大鼠，收集血清、胰腺组织标本进行相应检测。本研究方案由西南医科大学实验动物伦理委员会审批（批准号swmu20220017），符合实验室动物管理与使用准则。

1.2.2 腹水量观察 建模24 h 后，观察各组大鼠死亡情况。大鼠采血后打开腹腔，尽量吸尽腹水，记录各组腹水量。

1.2.3 血清LPS 测定 将贮存在-80 ℃冰箱的血清样本取出，置于冰上解冻，按照LPS测定试剂盒说明书进行操作，利用多功能酶标仪检测580 nm 波长处光密度（OD）值，根据公式计算血清LPS水平。每组随机抽取5个样本进行检测。

1.2.4 ELISA 检测血清IL-6、TNF-α 水平 将-80 ℃保存的血清样本放置在冰上解冻，操作步骤完全按照相应指标的ELISA试剂盒说明书进行，最后使用多功能酶标仪测量样本在450 nm波长处的OD值，绘制标准曲线，计算血清中IL-6、TNF-α水平。每组随机抽取5个样本进行检测。

1.2.5 胰腺组织病理学检测 从SD 大鼠分离胰腺组织，取部分置于4%多聚甲醛固定过夜，脱水，石蜡固定，切片，脱蜡脱苯，苏木精-伊红（HE）染色，在荧光正置显微镜下观察胰腺组织病理变化情况，并参考Schmidt 等［9］的标准化评分系统，对大鼠胰腺组织切片进行病理学评分。每组随机抽取5个样本进行检测。

1.2.6 蛋白质免疫印迹法检测胰腺组织TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达水平 将分离自SD大鼠的部分胰腺组织置于EP 管中，液氮速冻后保存至-80 ℃冰箱。取部分冰冻组织，在液氮中研磨成粉末状，加入蛋白裂解液，冰上超声裂解10 min，低温离心后取上清液，按照BCA 试剂盒说明书测量总蛋白浓度。取30µg 蛋白行10%SDS-PAGE，并将凝胶上的目的蛋白转移至PVDF 膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h 后，添加β-actin、TLR4、MyD88、NF-κB p65 一抗（稀释比例均为1∶1 000），于4 ℃摇床孵育PVDF 膜过夜，随后用山羊抗小鼠（稀释比例为1∶3 000）或山羊抗兔（稀释比例为1∶5 000）二抗在室温下孵育2 h；最后将ECL 发光液浸润PVDF 膜，利用电化学发光成像分析系统显影。用Image J 软件分析各个蛋白条带的灰度值，以目的蛋白与β-actin 的灰度值之比代表目的蛋白的相对表达量。每组随机抽取3 个样本进行检测。

1.2.7 RT-qPCR 法检测胰腺组织IL-6、TNF-α、TLR4、MyD88、NF-κB mRNA 表达水平 取各组部分SD 大鼠胰腺组织，在液氮中研磨成粉末，并转移至无RNA 酶的EP 管中，加入RZ 裂解液（50～100 mg 组织加入1 mL 裂解液），后续步骤按照动物组织总RNA提取试剂盒说明书进行操作，提取总RNA，测量RNA 浓度，按照逆转录试剂盒及qPCR 试剂盒说明书的操作步骤进行RT-qPCR。引物序列见表1。每组随机检测3 个样本，每个样本设计3 个复孔；选择甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参基因，反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃5 s，55 ℃10 s，72 ℃15 s，共循环40 次。根据Ct值计算2-ΔΔCt得到目的基因的相对表达量。

Tab.1 Primer sequences表1 引物序列

1.3 统计学方法 采用SPSS 25.0软件和GraphPad Prism 8.0软件进行数据分析。计量资料经Shapiro-Wilk检验均呈正态分布，以表示，3组间均数比较用单因素方差分析，组间多重比较用Bonferroni法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 UroA对SAP大鼠胰腺病理损伤的影响 HE染色显示Sham 组胰腺组织结构完整，部分间质水肿，可见少量炎性细胞浸润，形态基本正常；SAP组胰腺小叶及腺体结构紊乱，大量炎性细胞浸润，胰腺组织大片坏死、出血；UroA 组胰腺病理损伤较SAP 组大鼠明显减轻，见图1。与Sham 组相比，SAP 组及UroA 组的胰腺病理学评分、血清LPS 水平升高，与SAP组相比，UroA组胰腺病理学评分、血清LPS水平降低，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表2。

Fig.1 Pancreatic tissue stained with HE in each group(×200)图1 各组大鼠胰腺组织HE染色（×200）

Tab.2 Comparison of pancreatic histopathological scores and serum lipase levels between the three groups表2 各组大鼠胰腺组织病理学评分及血清LPS水平比较（n=5，）

Tab.2 Comparison of pancreatic histopathological scores and serum lipase levels between the three groups表2 各组大鼠胰腺组织病理学评分及血清LPS水平比较（n=5，）

＊＊P＜0.01；a 与Sham 组比较，b 与SAP 组比较，P＜0.05；表3—5同。

组别胰腺病理学评分（分）血清LPS（U/L）Sham组SAP组UroA组F 3.10±0.96 13.20±1.15a 9.90±0.65ab 148.729＊＊55.19±9.94 139.70±5.36a 90.82±7.19ab 181.114＊＊

2.2 UroA对SAP大鼠腹水量的影响 Sham组、SAP组及UroA 组大鼠分别死亡0、5、2 只。Sham 组、SAP组及UroA 组的腹水量（mL）分别为0.42±0.30、17.10±3.40、1.64±0.69，差异有统计学意义（n=5，F=107.086，P＜0.01）。与Sham 组相比，SAP 组腹水量增加，与SAP 组相比，UroA 组腹水量减少（均P＜0.05）。

2.3 UroA 对SAP 大鼠血清及胰腺组织炎性因子表达水平的影响 与Sham组相比，SAP组大鼠血清及胰腺组织的IL-6、TNF-α 的表达升高（P＜0.05）；与SAP 组相比，UroA 组大鼠血清及胰腺IL-6、TNF-α的表达水平降低（P＜0.05），见表3。

Tab.3 Comparison of IL-6 and TNF-α in serum and pancreatic tissue of rats between the three groups表3 3组大鼠血清和胰腺组织IL-6、TNF-α的表达水平比较（）

Tab.3 Comparison of IL-6 and TNF-α in serum and pancreatic tissue of rats between the three groups表3 3组大鼠血清和胰腺组织IL-6、TNF-α的表达水平比较（）

组别Sham组SAP组UroA组F血清（n=5，ng/L）IL-6 28.49±5.50 66.15±4.09a 39.55±3.61ab 93.652＊＊TNF-α 83.98±4.14 172.80±24.53a 102.00±10.11b 45.869＊＊胰腺组织（n=3）IL-6 1.24±0.46 48.72±4.99a 24.48±8.14ab 55.545＊＊TNF-α 1.00±0.06 5.34±0.38a 1.78±0.06ab 319.328＊＊

2.4 UroA 对SAP 大鼠TLR4/NF-κB mRNA 和蛋白表达水平的影响 SAP 组TLR4、MyD88、NF-κB 的mRNA水平及蛋白表达均高于Sham组，与SAP组比较，UroA组TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA水平和蛋白表达则下降，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4、5，图2。

Fig.2 Western blot detection of protein expression levels of TLR4,MyD88 and NF-κB p65 in pancreatic tissue图2 免疫印迹法检测大鼠胰腺组织TLR4、MyD88、NF-κB p65的蛋白表达

Tab.4 Comparision of relative levels of TLR4,MyD88 and NF-κB mRNA in pancreatic tissue of rats between the three groups表4 各组大鼠胰腺组织匀浆中TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达水平比较（n=3，）

Tab.4 Comparision of relative levels of TLR4,MyD88 and NF-κB mRNA in pancreatic tissue of rats between the three groups表4 各组大鼠胰腺组织匀浆中TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达水平比较（n=3，）

组别Sham组SAP组UroA组F 1.01±0.02 2.43±0.17a 1.12±0.17b 94.740＊＊1.01±0.20 5.24±0.36a 3.78±0.12ab 225.088＊＊0.99±0.02 1.94±0.09a 1.56±0.12ab 86.994＊＊TLR4MyD88NF-κB

Tab.5 Comparison of relative protein expression levels of TLR4,MyD88 and NF-κB p65 in pancreatic tissue of rats between the three groups表5 各组大鼠胰腺组织中TLR4、MyD88及NF-κB p65蛋白表达水平比较（n=3，）

Tab.5 Comparison of relative protein expression levels of TLR4,MyD88 and NF-κB p65 in pancreatic tissue of rats between the three groups表5 各组大鼠胰腺组织中TLR4、MyD88及NF-κB p65蛋白表达水平比较（n=3，）

组别Sham组SAP组UroA组F TLR4 0.25±0.10 0.95±0.16a 0.59±0.15ab 18.592＊＊MyD88 0.36±0.10 0.91±0.06a 0.49±0.12b 27.074＊＊NF-κB p65 0.27±0.04 0.98±0.07a 0.42±0.09ab 85.135＊＊

3 讨论

SAP 是一种由多种原因引起的炎症性疾病，无论其病因如何，最终结果是导致局部甚至全身炎性反应。SAP 时炎性细胞因子的过度生成，以致大量细胞因子形成复杂的炎症级联反应，介导了胰腺局部和胰腺外脏器功能的损害，导致全身炎性反应综合征（SIRS）、多器官功能障碍，甚至死亡。关于如何控制SAP时的炎症反应，近年做了大量的探索研究，但仍缺乏特异有效的针对性药物。针对天然植物来源的药物开发已成为药理学研究的热点之一。UroA 来源于石榴、蓝莓、核桃等富含鞣花酸类物质的食物，由肠道微生物代谢产生后分布在血浆和组织中。UroA具有良好的耐受性和安全性［10］，其较好的抗炎效果使其在治疗SAP方面具有理论可行性和临床转化可能。因此本研究探讨了UroA 对SAP 胰腺病理损伤的作用。研究发现应用UroA后，SAP大鼠腹水量减少，血清脂肪酶降低，胰腺病理损伤明显改善，显示UroA干预对SAP大鼠起到了保护作用。

UroA具有抗炎作用，已在多种炎症性疾病中得到证实［7,11］。Wang 等［12］研究发现UroA 通过减弱促炎细胞因子TNF-α、IL-1β等的表达，减轻肾缺血再灌注损伤。尽管已有多项研究报道了UroA 的抗炎活性，但目前尚鲜见研究报道UroA对SAP中炎症反应的影响。本研究发现UroA 组大鼠血清及胰腺组织IL-6、TNF-α 的水平较SAP 组明显降低，表明了UroA在SAP中具有抗炎作用，并有可能通过抑制炎症细胞因子的释放，从而改善SAP时的胰腺损伤。

近年来大量研究显示，TLR4/NF-κB通路在SAP发生发展中起到了重要作用。Li等［13］研究发现高迁移率族蛋白B1作为一种刺激因子，通过激活其下游的TLR4/NF-κB信号通路加重了实验性SAP中胰腺损伤。TLR4是模式识别受体家族中的一员，作为一种跨膜蛋白，主要分布在单核/巨噬细胞表面，在脂多糖等特定刺激下活化，主要通过依赖MyD88途径激活NF-κB，推动SAP 的病理进展［14］。NF-κB 是一类核转录因子，能与多种基因启动子区域的特定位点发生特异性结合，并促进DNA 转录，其异常活化导致炎性细胞因子的释放失控，是导致胰腺损伤的重要机制［13，15］。有研究表明，普拉克索通过抑制TLR4/NF-κB/NLRP3 炎性小体通路活化改善了AP中的胰腺炎症及细胞凋亡［5］。Fu 等［16］研究发现UroA可通过抑制PI3K/AKT/NF-κB信号通路活化减少IL-1β、IL-6和TNF-α等炎症介质的产生，减轻骨关节炎的炎症反应。但UroA 的抗炎反应是否与TLR4 及MyD88 相关尚鲜见报道。本研究发现，与Sham组相比，TLR4、MyD88、NF-κB在SAP组大鼠胰腺中的表达明显升高，这一结果验证了TLR4/NF-κB信号通路在SAP中的促炎作用，与既往研究［17］一致。UroA 干预后，大鼠胰腺组织TLR4/NF-κB 信号通路相关蛋白及炎性因子表达下降，提示UroA可能通过抑制TLR4/NF-κB 信号通路活化，从而减少炎性因子的释放，发挥抗炎作用。

综上，UroA 可能通过阻断TLR4/NF-κB 信号通路活化，从而减少SAP大鼠炎性因子的释放，达到对胰腺的保护作用，表明了UroA对SAP中胰腺损伤具有潜在治疗价值。但SAP 病情复杂，发病机制涉及多种因素，UroA在SAP中的相关作用机制仍需进一步研究。