NLRP3-CAMKⅡ-IRE-1α通路激活诱导氧化应激增强对糖尿病大鼠心室重构的影响

周梦竹，张海凤，张雪，张跃，程立君，刘彤，刘长乐

目前糖尿病（DM）的患病率在全球范围内迅速上升，预计到2045 年将有6.93 亿人受到影响，相比2017 年受影响人数增加50%。在高血糖应激状态下，心肌细胞的稳态被打破，从而促进心肌病的发展［1-2］。糖尿病性心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）促使心脏结构和功能的改变，在高血糖条件下，炎症、氧化应激、内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）和钙稳态失衡的相互作用促进心室重构的进展，也是心肌肥厚和心肌纤维化的复杂病理过程［3］。早期心室重构以适应内环境变化，但随着时间的推移心室重构的失调导致心功能下降［3-4］。格列本脲（glibenclamide，GLB）是一种磺酰脲类降糖药，同时也是核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎性小体的特异性抑制剂，不仅具有降糖作用，也可抑制炎症反应，减少组织纤维化［5-6］。但鲜见GLB与ERS和氧化应激的相关研究。本研究旨在探索NLRP3 激活ERS 和促进氧化应激是否参与DM 大鼠心室重构以及GLB 能否改善此变化。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 链脲佐菌素、柠檬酸钠缓冲液、HE染色试剂盒和Masson 染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；GLB（2.5 mg×100 片）购自天津太平洋制药有限公司；二氢乙锭（DHE）购自美国US EVERBRIGHT 公司；血糖试纸条、血糖仪购自三诺生物传感股份有限公司；PVDF膜购自德国GE Healthcare 公司；双辛酸（BCA）蛋白测定试剂盒购自美国Thermo Scientific公司；兔抗NLRP3抗体购自美国NOVUSBIO公司；兔抗鼠胱天蛋白酶-1（caspase-1）多克隆抗体购自美国Proteintech 公司；兔抗鼠肌醇需求激酶-1α（inositol-requiring protein-1α，IRE-1α）抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；兔抗鼠钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ（calmodulindependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ）抗体、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2（NADPH-oxidase 2，NOX2）抗体和NOX4 抗体均购自英国Abcam 公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔二抗购自美国Promega 公司；小动物心脏彩色超声仪购自美国Visual Sonics 公司；无创血压计购自Softron biotechnology 公司；心外膜激活映射标测系统购自英国Mapping Lab 公司；化学发光成像分析系统购自上海Tanon科技股份有限公司；正置荧光显微镜购自日本Olympus公司；TP1020全自动生物组织脱水机、病理石蜡切片机、石蜡切片展片机、病理组织烤片机、冰冻切片机购自德国Leica公司；生物组织包埋机（BMJ-1）购自上海珂淮有限公司。

1.2 实验动物及分组 36 只6 周龄健康雄性Sprague-Dawley 大鼠购自北京华阜康生物科技有限公司，体质量200～220 g，按随机数字表法分为对照组（CTL组）、糖尿病组（DM 组）和糖尿病+GLB 组（GLB 组），每组12 只。每组按随机数字表法抽取6只大鼠进行超声心动图检测、血流动力学实验、组织病理学检查及蛋白免疫印迹分析，另外6只大鼠进行心外膜激活映射标测。DM 模型建立前大鼠禁食12 h，通过单次腹腔注射链脲佐菌素（溶于枸橼酸缓冲液）55 mg/kg进行建模，48 h 后，通过检测尾静脉血糖验证DM 模型，单次空腹血糖≥14 mmol/L 或两次空腹血糖≥11 mmol/L 为建模成功。GLB 组于造模成功后每日上午灌胃GLB 1.25 mg/kg，连续8周，CTL 组不进行任何干预。将3 组大鼠在相同温度、湿度，通风良好，水食物供应充足喂养。8周后记录各组血糖、血压和体质量。本实验所有操作均经天津医科大学动物区域伦理委员会批准。

1.3 血流动力学指标测量 将大鼠置于安静室内，10 min后待大鼠稳定并适应环境，用网袋固定大鼠，并对尾巴进行加温以扩张血管，待大鼠稳定后测量心率、收缩压、舒张压。每只大鼠共测量5次，取平均值。

1.4 心脏超声检查 造模成功8 周后，用1.5%异氟醚麻醉大鼠并连接体表心电图，用心脏彩色超声仪进行检查。分别从胸骨旁左心室长轴位、短轴位和心尖四腔切面评估肺动脉血流加速时间、平均肺动脉压、收缩期与舒张期室间隔、心室前壁和心室后壁厚度。各测量3次，取平均值。

1.5 心外膜激活映射标测 造模成功8周后，大鼠麻醉后游离气管并进行气管插管，连接呼吸机后开胸行心外膜激活映射标测。将36个电极（6×6格）置于心脏表面，通过多通道矩阵电生理标测系统选取心室传导均匀的心室波测量心室传导速度，选取至少3 个连续心室波，计算心室心外膜传导速度、心室绝对不均匀性及心室不均匀指数。所有结果均采用EMapScope 4.0软件进行分析。

1.6 蛋白免疫印迹实验检测组织蛋白表达 造模成功8 周后，将大鼠麻醉处死，取心室组织，计算心室体质量比。加入1%蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的RIPA 缓冲液提取心室组织蛋白。组织匀浆用12 000×g离心20 min，取上清液备用。采用BCA 蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。样品蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，转移到0.45µm PVDF 膜上。5%脱脂奶粉封片1 h 后，与特异性一抗，包括炎性相关蛋白NLRP3（1∶500）、caspase-1（1∶1 000），ERS相关蛋白CaMKⅡ（1∶1 000）、IRE-1α（1∶1 000），氧化应激相关蛋白NOX2（1∶1 000）、NOX4（1∶1 000）4 ℃孵育过夜。然后用含Tween-20 的Tris 盐酸缓冲液（TBST）清洗PVDF 片，用与HRP 结合的二抗孵育1 h，TBST 再次漂洗，检测蛋白。抗原抗体反应采用多化学发光成像分析系统进行可视化。采用Image J软件进行半定量分析。

1.7 荧光染色法测定活性氧（ROS）含量 用10µmol/L DHE染色心室组织冷冻切片（厚度10µm），37 ℃加湿箱孵育切片30 min 后，用磷酸盐缓冲液冲洗10 min，重复3 次，随后立即用玻片封片，在相同条件下用荧光显微镜成像，并用Image J软件分析图像的平均灰度值以量化ROS水平。

1.8 HE 染色及Masson 染色观察心室组织细胞形态和纤维化 心室组织样品置于10%福尔马林中固定，石蜡包埋，切成4～5µm切片。通过HE染色和改良Masson染色观察细胞形态和纤维化区域。每个样本取3个随机区域观察并分析心室胶原体积分数（collagen volume fraction，CVF）。用Image J软件分析结果。

1.9 统计学方法 采用GraphPad Prism 9.3.1 软件进行数据分析。符合正态分布的数据以表示。多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间多重比较行Tukey检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组基线特征、血流动力学和超声心动图指标比较 与CTL 组相比，DM 组的血糖升高，心室体质量比增大，收缩期和舒张期室间隔厚度、左心室前壁厚度增加，体质量降低（P＜0.05）。与DM 组相比，GLB 组收缩期和舒张期室间隔厚度、左心室前壁厚度减低（P＜0.05）。3组间收缩压、舒张压、肺动脉血流加速时间、平均肺动脉压、收缩期和舒张期左心室后壁厚度比较差异无统计学意义。见表1。

Tab.1 Comparison of baseline characteristics,hemodynamic and echocardiographic indexes between the three groups表1 3组基线特征、血流动力学和超声心动图指标比较（n=6，）

Tab.1 Comparison of baseline characteristics,hemodynamic and echocardiographic indexes between the three groups表1 3组基线特征、血流动力学和超声心动图指标比较（n=6，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a与CTL组比较，b与DM组比较，P＜0.05；表2、3同；1 mmHg=0.133 kPa。

组别CTL组DM组GLB组F血糖（mmol/L）7.67±1.32 27.72±5.73a 28.33±2.24a 62.870＊＊体质量（g）424.20±33.97 233.20±65.85a 267.50±68.76a 18.260＊＊心室体质量比（‰）2.93±0.17 3.35±0.25a 3.08±0.12 7.830＊＊收缩压（mmHg）119.30±9.37 126.20±7.94 120.50±10.77 0.902舒张压（mmHg）85.67±7.17 82.33±9.42 88.17±8.35 0.735心率（次/min）346.50±30.35 295.20±43.80 346.80±29.71 4.275＊肺动脉血流加速时间（ms）32.22±3.16 29.90±6.87 32.58±4.72 0.476组别CTL组DM组GLB组F平均肺动脉压（mmHg）70.03±1.96 71.46±4.26 69.80±2.92 0.476收缩期室间隔厚度（mm）2.69±0.25 3.41±0.33a 2.62±0.26b 14.350＊＊舒张期室间隔厚度（mm）1.63±0.24 2.06±0.26a 1.54±0.22b 8.134＊＊收缩期左心室前壁厚度（mm）2.89±0.19 3.48±0.42a 2.24±0.32ab 22.140＊＊舒张期左心室前壁厚度（mm）1.76±0.06 2.39±0.36a 1.47±0.17b 24.910＊＊收缩期左心室后壁厚度（mm）2.73±0.42 3.00±0.52 2.64±0.41 1.039舒张期左心室后壁厚度（mm）1.96±0.25 2.11±0.45 1.71±0.39 1.785

2.2 心外膜激活映射标测结果比较 与CTL 组相比，DM组左、右心室心外膜传导速度减慢，右心室不均匀指数增加（P＜0.05）。与DM组相比，GLB组左、右心室心外膜传导速度增快，左心室绝对不均匀性和不均匀指数降低（P＜0.05）。见表2、图1。

Fig.1 Epicardial activation mapping in the three groups图1 3组心外膜激活映射图像

Tab.2 Comparison of epicardial activation mapping of rats between the three groups表2 3组大鼠心外膜激活映射标测结果比较（n=6，）

Tab.2 Comparison of epicardial activation mapping of rats between the three groups表2 3组大鼠心外膜激活映射标测结果比较（n=6，）

组别CTL组DM组GLB组F左心室心外膜传导速度（m/s）1.05±0.27 0.52±0.24a 1.08±0.29b 7.066＊＊左心室绝对不均匀性2.25±0.23 4.40±2.21 1.68±0.20b 6.230＊左心室不均匀指数1.66±0.19 2.56±0.89 1.49±0.20b 5.635＊组别CTL组DM组GLB组F右心室心外膜传导速度（m/s）0.87±0.20 0.58±0.15a 1.09±0.16b 11.620＊＊右心室绝对不均匀性2.32±0.47 4.68±3.09 2.39±0.17 2.759右心室不均匀指数1.38±0.13 2.01±0.43a 1.65±0.35 4.620＊

2.3 各组炎症、ERS和氧化应激相关蛋白表达水平比较 与CTL 组比较，DM 组NLRP3、caspase-1、CaMKⅡ、IRE-1α、NOX2 和NOX4 蛋白表达水平升高（P＜0.05）。与DM 组比较，GLB 组NLRP3、caspase-1、CaMKⅡ、IRE-1α、NOX2 和NOX4 蛋白表达水平下降（P＜0.05）。见表3、图2。

Fig.2 Protein expression in ventricular tissue in the three groups图2 3组心室组织蛋白表达情况

Tab.3 Comparison of NLRP3,caspase-1,CaMK Ⅱ,IRE-1α,NOX2 and NOX4 protein expression levels between the three groups表3 3组NLRP3、caspase-1、CaMKⅡ、IRE-1α、NOX2和NOX4蛋白表达水平比较（n=6，）

Tab.3 Comparison of NLRP3,caspase-1,CaMK Ⅱ,IRE-1α,NOX2 and NOX4 protein expression levels between the three groups表3 3组NLRP3、caspase-1、CaMKⅡ、IRE-1α、NOX2和NOX4蛋白表达水平比较（n=6，）

组别CTL组DM组GLB组F NLRP3 0.80±0.27 1.26±0.33a 0.81±0.18b 5.814＊caspase-1 0.41±0.19 0.81±0.10a 0.36±0.20b 12.320＊＊CaMKⅡ1.17±0.16 1.50±0.28a 1.12±0.07b 7.092＊＊组别CTL组DM组GLB组F IRE-1α 0.28±0.09 0.56±0.13a 0.34±0.10b 10.960＊＊NOX2 1.15±0.34 1.93±0.45a 1.25±0.25b 8.459＊＊NOX4 0.92±0.22 1.60±0.21a 0.92±0.21b 20.000＊＊

2.4 ROS 检测结果 CTL 组、DM 组和GLB 组平均灰度值分别为349.4±221.6、1 353.0±590.0 和509.3±265.9，组间差异有统计学意义（F=11.180，P＜0.01）。与CTL 组比较，DM 组平均灰度值增大，心室肌ROS产生增多（P＜0.01）。与DM 组比较，GLB 组平均灰度值减小，心室肌ROS产生减少（P＜0.01）。见图3。

Fig.3 Production of ROS in ventricular tissue in the three groups(DHE staining,×100)图3 3组心室组织ROS产生情况（DHE染色，×100）

2.5 组织病理学染色结果 与CTL 组比较，DM 组心室肌细胞排列紊乱，而GLB 组较DM 组紊乱程度改善，CTL组、DM组和GLB组CVF（%）分别为2.06±0.27、8.47±1.31 和3.72±0.63，3 组差异有统计学意义（F=91.860，P＜0.01）。与CTL组比较，DM组CVF升高（P＜0.05），心室肌纤维化程度加重；与DM 组比较，GLB 组CVF 降低（P＜0.05），心室肌纤维化程度减轻。见图4。

Fig.4 Pathological staining results of ventricular muscle in the three groups图4 3组间心室肌病理染色结果

3 讨论

在DCM的发展过程中，代谢紊乱会导致心脏结构和功能改变，促进心脏重构、纤维化和功能障碍。心室重构主要包括电重构和结构重构［3］。Zhan等［7］研究表明，DM 大鼠心外膜传导速度降低，绝对不均匀性和不均匀指数增加。高血糖环境下，心脏复极时间延长，且离散程度和不均一性增加［8］。本研究通过心外膜激活映射标测评估电重构，结果显示DM组较CTL 组心室外膜传导速度减慢，右心室不均匀指数增加，而GLB组较DM组心室外膜传导速度、左心室绝对不均匀性及不均匀指数有所改善。心外膜心电传导不均匀性升高，心电传导方向离散程度增大，可能更容易导致心律失常。心肌肥大和纤维化是DCM 结构重构的代表性特征［9］。本研究通过心脏超声和病理染色结果对心脏结构重构进行评估发现，与CTL 相比，DM 大鼠心室体质量比、室间隔厚度、左心室前壁厚度增加，心室肌细胞排列紊乱，CVF升高，组织纤维化明显；而GLB组较DM组室间隔和左心室前壁厚度有所改善，心肌细胞排列紊乱程度减轻，纤维化程度减轻，证实DM会对心脏产生不利影响，但这仅是DCM 发生的表观现象，其分子机制尚不明确。

目前研究表明，DCM与炎症、ERS和氧化应激关系密切，三者共同促进DCM发生发展［10］。多种炎症通路的活化在DCM中发挥重要作用，其中NLRP3炎性小体作为经典的炎性因子被广泛研究。NLRP3是一种常见的先天免疫信号受体，在炎症性疾病的刺激和激活下，诱导多种类型细胞死亡［11-12］。NLRP3炎性小体的活化是一个连续的过程，首先需要触发事件诱导NLRP3表达上调，之后NLRP3与含半胱天冬酶募集域的凋亡相关斑点样蛋白和caspase-l 组装成具有酶活性的多蛋白复合物，激活下游经典焦亡通路，进一步聚集炎性细胞，扩大炎症反应［13］。本课题组前期研究证实，NLRP3/caspase-1/Gal-3 信号通路参与调节DM兔模型的心房重构［14］。GLB作为NLRP3 炎性小体抑制剂，具有抗炎和抗氧化特性［15-16］。既往研究表明，GLB 抑制NLRP3 表达后可减弱高脂饮食大鼠体内的超氧化物生成、脂质过氧化，降低NOX2蛋白水平，改善抗氧化状态和胰岛素信号通路［17］。本研究发现，与CTL 组相比，DM 大鼠心脏组织中NLRP3和caspase-1蛋白表达增多，炎症反应增强，证实DM 作为触发点能够使NLRP3 表达上调，引起炎症反应；与DM 组相比，GLB 组NLRP3和caspase-1 蛋白表达下调，证实GLB 对NLRP3 的抑制作用可减弱DM大鼠体内炎症反应。

NLRP3 炎性小体和ERS 参与体内多种病理生理过程。Heijman等［18］研究表明，心脏手术后房颤患者心房肌细胞NLRP3炎性小体表达增强，对小鼠心房肌细胞予白细胞介素-1β刺激也能增强心房肌细胞NLRP3 和CaMKⅡ的表达。CaMKⅡ是一个多效应信号分子，在高血糖、氧化应激、缺氧和缺血性损伤条件下，CaMKⅡ活化导致细胞内Ca2+超载，进一步触发ERS，促进心肌细胞死亡［19］。NLRP3 炎性小体可能通过调节CaMKⅡ表达启动ERS。ERS 是细胞的一种保护性应激反应，是细胞应对内质网腔内错误折叠与未折叠蛋白聚集以及钙平衡紊乱等状况而做出的反应。未折叠蛋白反应（unfolded protein reaction，UPR）是一种信号转导途径，由ERS激活，维持蛋白质稳态和细胞的分泌功能［20-22］。UPR通路包括3 个主要的信号级联，分别由IRE-1α、蛋白激酶RNA 样内质网激酶和激活转录因子6 启动。慢性ERS 可通过刺激IRE-1α 上调启动UPR［23］。在DM中，NLRP3 过度表达导致CaMKⅡ表达上调，诱发IRE-1α相关的ERS过度活化，进而导致氧化应激反应增强。氧化应激通过脂质过氧化、DNA 损伤和线粒体功能障碍在DM各种并发症的病理生理学中起关键作用［24-26］。ROS 与NADPH 是细胞内各种氧化应激诱导因子中的关键因子，DM 血糖波动可促进ROS、NADPH过度生成［27-28］。NADPH是一个蛋白质家族，包括NOX1-5 和Duox 1/2 共7 个成员，与心肌细胞ER 较为密切相关的亚型是NOX2、NOX4［29］。本研究发现，与CTL 组相比，DM 组大鼠心室肌组织中NLRP3/CaMKⅡ/IRE-1α 和氧化应激相关产物NOX2、NOX4表达上调，ROS产生增多。与DM组相比，GLB 组NLRP3/CaMK Ⅱ/IRE-1α 表达下调，NOX2、NOX4 水平下降，ROS 产生减少，表明在高糖状态下，NLRP3 活化，进而激活ERS，加剧细胞内氧化应激反应，而GLB 抑制NLRP3 表达后，炎症水平减轻，ERS 反应减弱，通路下传受到抑制，心室肌细胞内氧化应激反应减弱，心功能得到改善。

综上所述，高血糖状态可诱发心室肌细胞NLRP3-CAMKⅡ-IRE-1α 通路表达上调，氧化应激增强，影响鼠心室重构，GLB可降低ERS和氧化应激水平，从而部分逆转心室重构，这可能为未来DCM临床治疗提供一种新的方法。