桃核承气汤对多囊卵巢综合征大鼠卵巢组织PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响

2023-07-06王毅王海娇祁麟崔玉娇陈晓王岩何红美

天津医药 2023年6期

王毅，王海娇，祁麟，崔玉娇，陈晓，王岩，何红美△

多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是一种常见的内分泌及生殖系统疾病，其主要特征有雄激素分泌过多、排卵功能障碍和慢性无排卵，影响全球4%育龄女性的健康［1-2］。PCOS的病因及遗传背景十分复杂，发病机制尚不清楚，目前的治疗仅是对症治疗，缺乏有效的治疗药物［3］。研究发现，磷脂酰肌醇3-激酶/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（phosphatidylinositol 3-kinase/serine/threonine protein kinase B/mammalian target of rapamycin，PI3K/AKT/mTOR）信号通路与卵巢功能调节密切相关，其在PCOS大鼠卵巢中处于显著抑制状态，激活该通路能有效促进卵泡发育及改善排卵障碍［4］。源自《伤寒论》的桃核承气汤由桃仁、大黄、甘草、桂枝及芒硝组成，在临床中常用于治疗盆腔炎、子宫内膜异位症等妇科疾病［5-6］。但桃核承气汤是否对PCOS 亦有治疗作用鲜见研究报道。本研究尝试通过分析桃核承气汤对PCOS 模型大鼠卵巢组织PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响，以期探讨其对PCOS的治疗作用及相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 8 周龄雌性SPF 级SD 大鼠100 只，体质量（230±10）g，购自青岛博隆实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK（鲁）2021-0015，在光照12 h/d 的常规环境中饲养。

1.1.2 主要试剂和仪器注射用脱氢表雄酮（批号SCBYS9180，南京北鱼生物科技有限公司）；二甲双胍（批号20210912，二甲双胍用生理盐水溶成浓度0.01 g/mL 的混悬液，石家庄以岭药业股份有限公司）；空腹血糖（FPG）检测试剂盒、逆转录试剂盒、ECL 试剂（批号FS13987、FS14229、FS17124，上海抚生实业有限公司）；空腹胰岛素（FINS）检测试剂盒、荧光定量PCR（qRT-PCR）试剂盒（批号MK6678B、MK6012，北京寰宇科创生物科技发展有限公司）；卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、雌二醇（E2）、睾酮（T）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒、苏木素伊红（HE）染色试剂盒（批号ZY7070-1、ZY7125-3、ZY7163-5、ZY7255-1、ZY9013-7，上海泽叶生物科技有限公司）；BCA蛋白定量试剂盒、兔抗鼠PI3K、AKT、mTOR、磷酸化PI3K（p-PI3K）、磷酸化AKT（p-AKT）、GAPDH 抗体、羊抗兔二抗（批号B00101-100、B4292、B9272、B2983、B2118、B4288、B2063、B7074，上海东寰生物科技有限公司）；WM-000 型血糖仪、Chameleon V 型酶标仪、VideometerLab UV 型凝胶成像仪（上海恪敏生物科技有限公司）；DMi8型显微镜、Mic-4型qRT-PCR仪（上海之江生物科技股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 桃核承气汤制备桃仁12 g、大黄12 g、甘草12 g、桂枝6 g，全部浸泡1 h 后，桃仁与甘草大火煎20 min 后加桂枝煎煮10 min，再加入大黄煎10 min后过滤残渣再煎30 min，合并两次煎液（第1 次煎煮后过滤残渣再煎30 min，为第2 次）后加入芒硝6 g，浓缩为含0.189 g/mL、0.378 g/mL、0.756 g/mL生药的药液备用。

1.2.2 PCOS模型构建及分组给药参照文献［7］构建PCOS模型：取84只大鼠进行造模，造模大鼠连续20 d于皮下注射脱氢表雄酮（60 mg/kg，脱氢表雄酮溶于0.2 mL 的注射用油剂）。于第21天开始连续4 d（1个动情周期）将生理盐水润湿后的棉拭子插入大鼠阴道内，逆时针转动3次后取出，进行涂片，观察造模大鼠阴道涂片，若阴道上皮持续角化、失去动情周期则为造模成功。4 只（4.76%）大鼠因仍存在动情周期即造模失败，80 只（95.24%）大鼠造模成功。另取16 只健康大鼠，连续20 d于皮下注射0.2 mL生理盐水作为对照组。将成功造模的80只大鼠按照随机数字表法分为PCOS组，二甲双胍组，桃核承气汤低、中、高剂量组，每组16只。二甲双胍组大鼠给予0.1 g/kg二甲双胍灌胃［7］；桃核承气汤低、中、高剂量组大鼠分别给予1.89 g/kg、3.78 g/kg、7.56 g/kg 桃核承气汤灌胃［8］；对照组和PCOS组大鼠给予生理盐水灌胃；各组灌胃体积均是10 mL/kg，1次/d，为期28 d。

1.2.3 大鼠血清指标检测实验结束后禁食12 h，于次日早晨尾静脉取血0.5 mL，通过血糖仪检测FPG，戊巴比妥钠麻醉大鼠后取腹主动脉血4 mL，离心（3 000 r/min、15 min）取上清液，使用FSH、LH、E2、T、FINS ELISA 试剂盒检测各指标水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）=FPG×FINS/22.5。

1.2.4 HE染色取血完毕后，颈椎脱臼处死8只大鼠，取其左侧卵巢组织，浸入4%多聚甲醛，经固定、脱水及石蜡包埋处理后，连续5µm切片，HE着色、封片，光镜下观察染色情况。

1.2.5 qRT-PCR 检测大鼠卵巢组织PI3K、AKT、mTOR mRNA表达情况取血完毕后，取另8只大鼠颈椎脱臼处死，取其左侧卵巢组织，经生理盐水清洗后保存于-80 ℃冰箱中（一部分用于qRT-PCR 实验，一部分用于蛋白免疫印迹实验）。将卵巢组织于研钵中研磨，并使用Trizol 法提取总RNA，检测其纯度及浓度，于冰上反转录成cDNA 后，qRTPCR 检测PI3K、AKT、mTOR mRNA 表达。qRT-PCR 扩增条件：95 ℃5 min，95 ℃15 s、55 ℃15 s 进行40 个循环，72 ℃30 s。反应体系共20µL：2µL cDNA（50 mg/L），10µL SYBR Green Master Mix，PCR上、下游引物（10µmol/L）各0.5µL，补充ddH2O 至20µL。通过2-ΔΔCt法分析各mRNA 表达水平，引物序列见表1，GAPDH为内参。引物由南京北鱼生物科技有限公司合成。

Tab.1 Primer sequence for qRT-PCR表1 qRT-PCR引物序列

1.2.6 蛋白免疫印迹法检测大鼠卵巢组织PI3K/AKT/mTOR通路蛋白表达取1.2.5所得卵巢组织，用组织裂解液裂解后匀浆，离心10 min（15 000 r/min），取上清液，BCA法检测上清液中蛋白浓度。配制10%分离胶、上样、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转至PVDF膜后，使用5%牛血清白蛋白封闭2 h，孵育兔抗鼠PI3K（1∶700）、AKT（1∶750）、mTOR（1∶820）、p-PI3K（1∶700）、p-AKT（1∶750）、GAPDH（1∶900）一抗过夜，次日经TBST 洗涤后孵育羊抗兔二抗（1∶1 900），漂洗后添加ECL 试剂显影，利用蛋白凝胶成像仪对条带进行扫描观察，Image J分析各条带灰度值，以GAPDH为内参计算目的蛋白表达。

1.3 统计学方法采用SPSS 24.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较行SNK-q检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 桃核承气汤对PCOS大鼠血清性激素水平的影响与对照组相比，PCOS组血清FSH、E2水平降低，LH、T 水平升高（P＜0.05）；与PCOS 组相比，二甲双胍组及桃核承气汤低、中、高剂量组血清FSH、E2水平升高，LH、T水平降低（P＜0.05）；与二甲双胍组相比，桃核承气汤低、中剂量组血清FSH、E2水平降低，LH、T 水平升高（P＜0.05），高剂量组变化差异无统计学意义（P＞0.05）；桃核承气汤低、中、高剂量组血清FSH、E2水平依次升高，LH、T 水平依次降低（P＜0.05）；见表2。

Tab.2 Changes in serum sex hormone levels in each group of rats表2 各组大鼠血清性激素水平变化（n=16，）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与PCOS 组比较，c与二甲双胍组比较，d与低剂量组比较，e与中剂量组比较，P＜0.05；表3—5同。

组别对照组PCOS组二甲双胍组低剂量组中剂量组高剂量组F FSH（IU/L）3.50±0.68 1.03±0.34a 3.41±0.45b 1.76±0.38bc 2.56±0.40bcd 3.39±0.41bde 80.629＊＊LH（IU/L）11.08±1.14 18.91±1.42a 11.39±1.40b 16.24±1.03bc 14.03±1.26bcd 11.20±1.04bde 111.039＊＊E2（pmol/L）24.14±3.25 6.03±0.98a 22.94±2.36b 10.20±1.35bc 16.03±1.52bcd 21.09±2.06bde 204.619＊＊T（ng/L）17.92±3.38 86.36±6.20a 18.76±5.33b 60.52±5.79bc 41.75±4.20bcd 20.01±4.92bde 488.227＊＊

2.2 桃核承气汤对PCOS 大鼠胰岛素抵抗的影响与对照组相比，PCOS 组血清FPG、FINS 和HOMA-IR 水平升高（P＜0.05）；与PCOS 组相比，二甲双胍组及桃核承气汤低、中、高剂量组血清FPG、FINS 和HOMA-IR 水平降低（P＜0.05）；与二甲双胍组相比，桃核承气汤低、中剂量组血清FPG、FINS 和HOMA-IR 水平升高（P＜0.05），高剂量组变化差异无统计学意义（P＞0.05）；桃核承气汤低、中、高剂量组血清FPG、FINS 和HOMA-IR 水平依次降低（P＜0.05）；见表3。

Tab.3 Changes of insulin resistance in each group of rats表3 各组大鼠胰岛素抵抗水平变化（n=16，）

组别对照组PCOS组二甲双胍组低剂量组中剂量组高剂量组F FPG（mmoL/L）5.59±0.38 7.80±0.33a 5.66±0.35b 7.01±0.30bc 6.42±0.41bcd 5.69±0.40bde 97.499＊＊FINS（mIU/L）64.17±5.10 124.23±7.86a 68.30±6.24b 101.25±5.33bc 85.00±6.27bcd 70.02±7.30bde 212.257＊＊HOMA-IR 15.94±2.21 43.07±3.28a 17.18±2.52b 31.55±3.76bc 24.25±2.02bcd 17.71±3.43bde 209.213＊＊

2.3 桃核承气汤对PCOS大鼠卵巢组织病理学的影响 HE染色结果显示，对照组大鼠卵巢黄体结构正常，可见不同发育阶段的卵泡，未见多囊样变；PCOS组大鼠卵泡体积增大，含卵泡液，且细胞间隙增大、黄体减少、泡膜细胞层增生；与PCOS组相比，二甲双胍组及桃核承气汤低、中、高剂量组大鼠卵泡体积减小、黄体数目增加、泡膜细胞层增生现象减轻；与二甲双胍组相比，桃核承气汤高剂量组上述现象无明显差异；见图1。

Fig.1 Histopathological observation of ovary in each group of rats(HE staining，×200)图1 各组大鼠卵巢组织病理学观察（HE染色，×200）

2.4 桃核承气汤对PCOS 大鼠卵巢组织中PI3K、AKT、mTOR mRNA 表达的影响与对照组相比，PCOS 组大鼠卵巢组织中PI3K、AKT、mTOR mRNA表达水平降低（P＜0.05）；与PCOS组相比，二甲双胍组及桃核承气汤低、中、高剂量组大鼠卵巢组织中PI3K、AKT、mTOR mRNA 表达水平升高（P＜0.05）；与二甲双胍组相比，桃核承气汤低、中剂量组大鼠卵巢组织中PI3K、AKT、mTOR mRNA 表达水平降低（P＜0.05），高剂量组变化差异无统计学意义（P＞0.05）；桃核承气汤低、中、高剂量组大鼠卵巢组织中PI3K、AKT、mTOR mRNA 表达水平依次升高（P＜0.05）；见表4。

Tab.4 Changes of PI3K,AKT and mTOR mRNA expression levels in ovarian tissue of rats in each group表4 各组大鼠卵巢组织中PI3K、AKT、mTOR mRNA表达水平变化（n=8，）

组别对照组PCOS组二甲双胍组低剂量组中剂量组高剂量组F PI3K mRNA 1.00±0.08 0.32±0.04a 1.01±0.07b 0.51±0.06bc 0.78±0.08bcd 0.98±0.10bde 123.934＊＊AKT mRNA 1.01±0.05 0.28±0.03a 1.00±0.10b 0.47±0.06bc 0.72±0.07bcd 0.97±0.11bde 135.045＊＊mTOR mRNA 0.99±0.09 0.16±0.02a 0.98±0.12b 0.40±0.06bc 0.65±0.08bcd 0.96±0.09bde 143.672＊＊

2.5 桃核承气汤对PCOS 大鼠卵巢组织中PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白表达的影响与对照组相比，PCOS 组大鼠卵巢组织中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、mTOR 蛋白表达水平降低（P＜0.05）；与PCOS组相比，二甲双胍组及桃核承气汤低、中、高剂量组大鼠卵巢组织中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、mTOR蛋白表达水平升高（P＜0.05）；与二甲双胍组相比，桃核承气汤低、中剂量组大鼠卵巢组织中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、mTOR 蛋白表达水平降低（P＜0.05），高剂量组变化差异无统计学意义（P＞0.05）；桃核承气汤低、中、高剂量组大鼠卵巢组织中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、mTOR 蛋白表达水平依次升高（P＜0.05）；见表5、图2。

Fig.2 Protein expression levels of PI3K/AKT/mTOR signaling pathway in ovarian tissue of rats in each group detected by Westren blot assay图2 蛋白免疫印迹法检测各组大鼠卵巢组织中PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白的表达

Tab.5 Comparison of protein expression levels of PI3K/AKT/mTOR signaling pathway in ovarian tissue of rats in each group表5 各组大鼠卵巢组织中PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白表达水平比较（n=8，）

组别对照组PCOS组二甲双胍组低剂量组中剂量组高剂量组F p-PI3K/PI3K 1.69±0.23 0.56±0.06a 1.61±0.27b 0.90±0.09bc 1.28±0.18bcd 1.58±0.20bde 47.072＊＊p-AKT/AKT 1.51±0.26 0.43±0.07a 1.49±0.27b 0.78±0.07bc 1.12±0.15bcd 1.47±0.21bde 44.354＊＊mTOR/GAPDH 1.39±0.20 0.32±0.04a 1.36±0.19b 0.66±0.06bc 0.98±0.10bcd 1.34±0.19bde 73.491＊＊

3 讨论

PCOS的特点是雄激素分泌过多、排卵异常及存在增大或多囊卵巢，是目前女性常见的内分泌疾病，常合并发生高胰岛素血症、血脂异常，亦是糖尿病和心血管疾病发生的危险因素［9-10］。目前PCOS 的病因尚未明确，治疗主要基于临床症状和经验，且不能完全治愈PCOS，口服避孕药是现今主要的治疗方法，但过多服用会增加静脉血栓栓塞的风险，因此仍需进一步研发其治疗药物［11-12］。

中医认为PCOS 病因为肾虚为本，病机为痰湿、肝郁、瘀血［13］。桃核承气汤由桃仁、大黄、甘草、桂枝及芒硝配置而成，大黄逐瘀泻热、桃仁活血祛瘀、桂枝通行血脉、芒硝泻热、甘草缓和护胃，诸药合用有活血、化瘀、泻热之功效［6］。桃核承气汤已用于临床治疗慢性盆腔痛［14］、血瘀型子宫内膜异位症［15］等妇科疾病。有学者认为桃核承气汤可能具有治疗PCOS患者闭经症状的功效［16］。PCOS通常与患者胰岛素抵抗的发生有关，抑制胰岛素分泌可逆转卵巢功能障碍，并降低雄激素水平［17］。本研究发现，桃核承气汤能够以剂量依赖性的方式增加PCOS 大鼠血清FSH、E2水平，降低LH、T、FPG、FINS 及HOMA-IR水平，并改善卵巢病理损伤程度；桃核承气汤高剂量组上述指标与二甲双胍组无明显差异，提示桃核承气汤能够有效改善PCOS 大鼠性激素的分泌及胰岛素抵抗，其可能成为PCOS的潜在治疗药物。

PI3K属于生长因子超家族成员之一，可通过激活AKT、mTOR 等通路下游因子发挥作用。有研究发现，PI3K/AKT/mTOR 信号通路参与调节包括代谢、生长和细胞增殖在内的细胞功能，且可控制不同生长因子和激素分泌过程［18-19］。有研究表明，PI3K/AKT/mTOR 信号通路异常会导致卵巢功能损伤，影响卵泡增殖，致使胰岛素抵抗的发生［20］。桂枝茯苓丸可通过激活PI3K/AKT/mTOR 信号通路来抑制颗粒细胞自噬，促进卵泡发育，从而改善PCOS 胰岛素抵抗大鼠排卵障碍［4］。纳米姜黄素可通过恢复PCOS大鼠PI3K/AKT/mTOR 通路，减轻胰岛素抵抗，促进大鼠性激素恢复正常水平［21］。本研究结果显示，PCOS 大鼠卵巢组织中PI3K/AKT/mTOR 通路相关分子mRNA 和蛋白表达受到抑制，与以往研究结果一致［4］，而桃核承气汤以剂量依赖性的方式显著增加卵巢组织中PI3K/AKT/mTOR 通路相关分子mRNA 和蛋白表达水平，提示桃核承气汤可促进PCOS 大鼠PI3K/AKT/mTOR 通路的激活，其对PCOS大鼠性激素水平及胰岛素抵抗的改善作用可能与激活该通路有关。

综上所述，桃核承气汤能够促进PCOS大鼠性激素正常水平的恢复，抑制胰岛素抵抗，这可能与其促进PI3K/AKT/mTOR 信号通路激活有关，但其对PI3K/AKT/mTOR 信号通路的具体作用机制尚待进一步探究。