微流控技术在化妆品安全与功效评价中的应用

叶洁忺 张静 张子霖 沙利烽 葛健军 陈早早 张娟 顾忠泽

关键词：化妆品；微流控技术；生物传感器；皮肤芯片；安全性；功效性

01前言

随着科技的发展以及人们对化妆品需求的增加，成分更复杂、功能更多样化的化妆品应运而生，检验化妆品安全性、功效性的重要性不言而喻。欧盟消费者安全科学委员会（SCCS） 在《化妆品成分测试及其安全性评估指南注释》中提出了化妆品成分和产品的安全性评估，要求包括急性毒性、腐蚀和刺激、皮肤致敏、皮肤吸收、慢性毒性等多项研究[1]。

微流控技术是一项综合性很强的多学科技术，具有在微米尺度上对流体进行精确控制和操纵的能力[2]，与传统基于实验室的宏观技术相比，其优势在于样本量小、高通量、低成本、高灵敏度。通过微流控技术与细胞生物学、组织工程技术、生物传感技术的融合，其在化妆品安全与功效评价中的应用潜力不容忽视。

02理化检测应用

生物传感器是一种将生物识别元件和生物材料与物理传感器结合来转换生物反应，以产生可测量信号的分析装置，微流控装置具有可移动性、操作透明性、可控性、准确性等优点[3，4]。结合微流体技术的生物传感器可以实现更快的处理和更高的效率，它们在化妆品检测中发挥着重要作用，如化妆品的有毒元素检测、活性物质检测等[5]。

2.1 重金属检测

在化妆品中，为了达到美白效果，经常添加汞，一旦过量，就会对皮肤和器官造成慢性毒性[6]。Chao Wu 等人[7] 开发了一种简单、快速和可视化的Hg2+ 检测策略。当Hg2+存在时，探针可以转化为G- 四联体DNA，并与血红蛋白结合形成DNA 酶，DNA 酶与沉淀的TMB 反应，在纸上产生可见的色带，色带长度与Hg2+ 浓度呈正相关。该传感器不仅能检测汞离子，并具有良好的再现性和满意的动态范围，检出限低至0.23 nM。该方法不仅提供了Hg2+ 的可视化快速筛查，而且可应用于其他金属离子的即时检测。

2.2 微生物检测

化妆品微生物指标检测化妆品微生物污染是社会关注的热点问题。被污染的微生物可能产生一些代谢物，刺激皮肤炎症或过敏反应。因此，规范有效的化妆品质量监督管理十分重要[5]。

Peng Zuo 等人[8] 发明了一种聚二甲基硅氧烷（PDMS）/ 纸/ 玻璃混合微流控系统，该系统基于集成的适配体功能化氧化石墨烯生物传感器，无需样本制备程序，可直接检测病原微生物。该微流体生物传感器装置只需10 分钟即可完成金黄色葡萄球菌的检测，相比于传统的培养法，大大缩短检测周期，并且在快速检测各种不同的其他细菌和病毒病原体方面具有很大的潜力。

2.3 抗生素检测

化妆品中的抗生素主要有甲硝唑、氯霉素、氧氟沙星等，能抑制皮肤微生物，增强皮肤抵抗细菌感染的能力，达到表面保护皮肤的效果。但长期使用含抗生素的化妆品会引起接触性皮炎等不良反应，如红斑、水肿、渗出、灼烧等，还会导致细菌对抗生素的耐药性增加，降低治疗效果[9，10]。

André Kling[11] 等人构建了一个可在临床相关样品中同时进行多重分析的电化学检测的微流控平台，能实现不同酶联分析的同时电化学读数，检测八种不同的分析物。该装置可在15 分钟内使用高灵敏度的生物分子传感器系统，同时完成样本中四环素和链球菌素这两种常用抗生素的检测。

03体外皮肤模型

2019 年，美国环境保护局正式宣布从2035 年起不再支持使用哺乳动物实验进行安全性测试的研究[12]。基于相关法律法规的颁布和大家对“3R” 原则（reduction，replacement， refinement） 的关注，建立稳定的体外皮肤模型以减少化妆品行业中传统的动物实验十分必要。

体外皮肤模型自20 世纪40 年代起开始大力发展。1948 年，首次出现对体外培养成年哺乳动物皮肤上皮的描述；1975 年，使用成纤维细胞培养的2D 皮肤模型出现；1976 年，第一个体外3D 皮肤模型出现，它更加接近了皮肤的自然结构和功能；随后出现了更多不同类型的人类皮肤等效物[13–19]。直至今日，已经发展出多种可用于化妆品安全性和功效性评价的功能化皮肤模型，其在化妆品行业中的应用前景十分广阔。

3.1 皮肤芯片

皮肤芯片（skin-on-a-chip） 是在微流控体系中培养皮肤组织，通过控制大量物理、生物化学参数如培养基流动、机械力、生物化学物质的浓度梯度等模拟真实人体皮肤的三维培养微环境，从而制造具有皮肤层级结构和附属结构的功能化的三维皮肤组织[20]。微流控设备的主要优点是流体流动和对微环境的精细控制，与静态培养相比，微流控系统可以精确控制各种参数，如机械力、介质流量和生物化学的梯度，改善细胞分化、形态、功能、细胞- 细胞和细胞- 基质相互作用，在皮肤芯片中集成成熟皮肤层和皮肤附属器官，且使其具有屏障功能[21–23]。

典型的皮肤芯片包括一個transwell 支架或一层多孔膜，将皮肤模型与底层灌注的培养基分开，允许药物或细胞因子等大分子扩散到皮肤模型中[24]。皮肤组织通常是由原代来源分离的细胞、干细胞分化的皮肤细胞或从活检组织中获得的皮肤所制造的[24]。主要相关细胞有角质形成细胞和成纤维细胞，也包括内皮细胞、黑色素细胞、免疫细胞等其他细胞，以及部分附属器官，例如血管、毛囊等[25，26]。

皮肤芯片应用于化妆品行业的优势不仅在于其更加还原人体真实皮肤结构，还能进行形态、活性、生化指标以及屏障功能、渗透性等皮肤特定功能检测，并支持在芯片上集成多种原位生物传感器，以提供更丰富的功能，如实时皮肤功能检测和药物动力学反应[27]。

3.2 安全性评估

在新的化妆品成分投放市场之前，需要对其安全性进行多方面评估，包括急性毒性、腐蚀和刺激、皮肤致敏等，皮肤芯片在安全性评估中主要用于皮肤致敏和皮肤刺激试验的毒理学评价。

3.2.1 毒理学评估

Jong Seung Lee 等人[28] 报道了一种能够对药物和化妆品化合物进行详细毒理学评估的混合人体皮肤芯片（ 见图1a）。该研究构建的皮肤—神经和皮肤—肝脏混合模型可以与代表性的分析方法相结合，如钙成像检测神经元活性、GSH/ROS 检测肝毒性，以进行实时定量皮肤致敏分析和皮肤施用化学物质的潜在肝毒性评估，有助于定量评估皮肤施用化学物质的毒理学效应。

3.2.2 化学刺激评估

Jing Zhang 等人[29] 构建了一种直接在微流控芯片内培养和分化人类角质形成细胞的高仿真表皮芯片（见图1b）， 主要通过细胞毒性对10 种已知毒素和非毒素的化学品进行体外刺激评价，且对刺激反应进行进一步评估，如炎症细胞因子释放等。检测结果表明，该皮肤芯片是体外皮肤刺激评估的潜在替代方案。同时，该系统还集成了TEER 传感器，可为后续检测提供便利。

3.3 功效评价

3.3.1 有效成分筛选

在开发化妆品的过程中，需要花费大量时间用于筛选有效活性成分及其组合。Zhengkun Chen 等人[30] 构建了一个在仿生和动态培养环境中生长大量真皮成纤维细胞球体（dermal fibroblast sphere，DFS）的微流控平臺（见图2）。该团队先在芯片上培养形成DFS，再探究不同剂量的维生素C 对DFS 生产I 型胶原蛋白和纤维连接蛋白的影响，实现在3 天内高效筛选维生素C 对蛋白质合成的影响。概念验证设计中，可以在单个芯片上实现12 种不同的成分或成分组合的高通量筛选，大大提高有效成分筛选的工作效率，缩短化妆品研发周期。

3.3.2 透皮吸收评价

在化妆品开发的过程中，化妆品通过皮肤屏障的渗透能力十分关键，需要对化妆品及其活性成分进行透皮吸收进行测试。相比于传统的Franz 细胞扩散法，使用皮肤芯片检测不仅能规避伦理问题和物种差异，也能更好地模拟皮肤微循环，得到更有效的数据。

Gopu Sriram 等人[31] 设计了一种用于全层人体皮肤的集成培养和测试的新型微流控装置（见图3a）。皮肤模型可以直接在设备中重建，并支持对其进行渗透和毒性研究。通过TEER 评价了皮肤组织的完整性，并通过渗透性实验比较了化合物咖啡因在皮肤芯片模型和静态皮肤模型中的稳态转运。实验证明，该装置能显著提高皮肤模型的质量和功能，并具有在同一平台上进行皮肤安全和渗透测试等下游检测的优势（ 见图3b）。

Varga-Medveczk 等人[32] 所开发的微流控扩散室（Microfluidic Diffusion Chamber，MDC） 可用于局部化妆品经皮吸收的体外/ 离体监测，并可根据具体实验需求进行部分改装。在验证试验中，将含咖啡因的乳膏放置在微芯片供体隔室中，并使用外周灌注，将人工皮肤中与人体皮肤中的咖啡因转运进行比较，结果显示出相似的转运动力学和良好的再现性。另外还研究了两种p 糖蛋白底物红霉素和奎尼丁在p 糖蛋白抑制剂PSC-833 存在和不存在情况下的透皮渗透曲线。以上实验表明，MDC 系统可用于研究皮肤芯片微流控系统与透皮成分传递和真皮屏障转运蛋白之间的相互作用，在化妆品透皮吸收评价中很有应用价值。

3.3.3 抗衰评价

体内衰老是由人体的代谢过程所引起的，外表老化与长期暴露于紫外线及其他环境因素有关[33]。人们期望使用化妆品达到预防或逆转皮肤老化的效果，以保持年轻健康的皮肤外观。因此有很多关于皮肤老化及抗衰老的研究正在不断开展[34，35]。

Subin Jeong 等人[36] 基于具有人类成纤维细胞和角质形成细胞的全层三维皮肤的柔性皮肤芯片，使用光交联剂和反映昼夜节律的机械刺激环境开发老化皮肤模型（见图4a，b）。在28 天的比较培养中，该模型全层皮肤当量收缩减少，表皮层厚度减少，β- 半乳糖苷酶基因表达增加，记录并证明了衰老的过程。这种新型芯片皮肤衰老模型的使用有望揭示新的衰老机制，可用于新的抗衰老物质的筛选和功效测试，对抗衰老化妆品的开发具有重要意义。

Gun Yongo Sung[37] 等人利用其所在团队开发的基于无泵PDMS 芯片系统的全层皮肤芯片（ 见图4c），检测姜黄叶提取物（CLLE） 作为一种化妆品原料对皮肤抗衰老的作用，结果显示50 μg/mL 的CLLE 作用后能显著增强皮肤模型的屏障功能，并且从基因、蛋白水平均显示丝聚蛋白、内批蛋白的表达增高。此研究表明，该无泵皮肤芯片模型可以作为动物研究的替代方案用于化妆品行业。

3.3.4 美白测试

黑色素的过度表达可导致黄褐斑等皮肤疾病，色素沉着问题也是医学领域的研究热点之一[38]。出于对美容和健康的双重考虑，人们对美白化妆品的需求逐步增加，检测化妆品的美白功效也成为产品开发的重要环节之一。

Qiwei Li 等人[39] 设计了一种可进行半固体、固体物质测试的三单元表皮芯片（ 见图5a）。在芯片中培养正常人角质形成细胞和正常人黑素细胞后，生成的稳定黑色素表皮呈现出多层结构，并具有屏障功能。该团队使用此表皮芯片测试了一种化妆品的美白效果，通过表征与分析证明了该化妆品在减少黑色素合成方面的功效（ 见图5b）。同时还使用该表皮芯片测试了四种化学物质的刺激和渗透特性。测试结果表明，该皮肤芯片可以为皮肤刺激或渗透的体外评估以及美容评估提供一种替代方法。

04总结与展望

随着微流控技术的不断发展，其在化妆品安全与功效评价中的应用也更加丰富多样。微流控技术和生物传感器的结合可以实现对化妆品中的重金属、微生物、抗生素进行快速检测，大大提高了检测特异性、灵敏度，进一步缩短了检测时间。但目前仍存在传感器识别精度不够准确，稳定性差，制备周期长等问题，还有待进一步改进。

此外，生物传感器不能用于检测化妆品中的所有物质，如防腐剂等。

皮肤芯片结合了微流控、微传感、组织工程等多种技术，能对真实人体皮肤进行一定程度上的模仿，有望部分替代传统动物试验。虽然目前已经出现多种皮肤芯片，但皮肤芯片真正商业化还面临着各种难题，如细胞类型的缺失、皮肤附属物的缺失、微血管的复制、皮肤表面微环境的构建等等，故而还原人体皮肤的程度有限，仍需进一步发展。2022 年12 月，我国第一个器官芯片国家标准《皮肤芯片通用技术要求》通过立项评审，将推进该领域技术发展和行业规范化。总体来说，皮肤芯片作为一项能集成多种原位生物传感器、联合多器官芯片的新兴技术，在实现多种化妆品评价方面的发展潜力是巨大的。