国际化妆品原料遗传毒性评估的关注点

文海若 柴学丽 吴辉 耿兴超

化妆品原料进行遗传毒性评价的背景介绍

化妆品是消费者长期日常使用的产品，涉及各个年龄段。因此，安全作为化妆品研发的首要因素，受到研发单位和监管机构的高度重视。《国际化妆品原料标准中文名称目录（2010 年版）》中已收录了超过15000 种化妆品原料。国内《已使用化妆品原料名称目录》中收载了近9000 种化妆品原料，目录以外的化妆品原料视为新原料，经过毒理学评估后方可使用。随着动物试验“3R”（reduction， replacement， refinement， 即动物使用的减少、替代和优化） 原则和替代理念的推广，欧盟国家自2013 年3 月起全面禁止销售经过动物试验的化妆品（含化妆品原料）。国际上，鼓励使用更先进的科学手段进行化妆品的安全性评价，包括以风险评估的方式减少终产品的毒理学检测，以及发展可靠的毒理学替代方法。

遗传毒性试验用于检测受试物是否存在诱导机体遗传物质损伤风险，从而预测受试物的致癌性。当遗传毒性试验结果为阳性时，提示受试物为潜在的人体致癌剂或致突变剂。肿瘤的发生机制复杂，而单一遗传毒性评价方法难以涵盖多种检测终点。故用于监管的遗传毒性数据，需来自评价终点互补的体外和体内试验组合，以从多种角度对受试物的遗传毒性风险进行评估。《化妆品安全技术规范》列出了6 项遗传毒性试验方法，并指出遗传毒性试验项目至少包括1 项基因突变试验和1 项染色体畸变试验。其中，细菌回复突变试验（Ames试验）是首选的遗传毒性试验，与体外哺乳动物细胞试验相结合，可检出绝大多数导致啮齿类动物肿瘤的物质，其检测的灵敏性达74.3%[2]。

传统遗传毒性试验方法评价化妆品原料时存在的问题

化妆品是由天然、合成或提取物质作为原料经调配加工而成的复配混合物，如油性原料、粉质原料等。化妆品原料的性质和有色成分可能对Ames 试验或体外染色体畸变试验体系产生干扰。如化妆品成分中含有组氨酸或色氨酸成分，则可能在Ames 试验中得到假阳性结果。一些在体外哺乳动物微核试验和染色体畸变试验中检测结果为阳性化学物质（如芳香胺类），在相同检测终点的体内研究中并不具有遗传毒性或致癌性[3]，其原因与体外试验系统缺乏体内代谢补偿机制有关。再如，微核试验结果易于受到pH 值和渗透压的影响。此外，具有氧化作用机制的化合物在体外评价体系中易于得到假阳性结果。而过高的细胞毒性是导致体外细胞致裂性试验假阳性结果的另一主要因素[4]。此外，化妆品多以局部皮肤外用为主，体内吸收和全身分布较少。如有潜在毒性风险的对苯二胺人体经皮吸收率仅为0.18%[5]，体外试验中通常选择较高浓度受试物与细胞作用，试验结果与人体毒性外推存在较高不确定性。传统遗传毒性评价方法在应用于化妆品原料药的评价时需进行一定优化。欧盟化妆品指令第7 次修订（2003/15/EC） 已于2009 年3 月开始禁止对化妆品成分进行体内遗传毒性试验。化妆品公司考虑到排除体外试验阳性结果所需的时间和资源成本，往往会摒弃体外试验中得到阳性结果的化学品原料。目前的体外遗传毒性试验研究重点在于如何提高试验结果的准确性，并找到更加合适且有效的体外替代模型进行遗传毒性评价[6]。

欧洲化妆品、盥洗用品和香水协会（EuropeanCosmetic .Toiletr y and Per fumer y A s sociation，COLIPA） 于2004 年成立了遗传毒性研究小组，一方面对现有体外标准遗传毒性试验方法进行改良，从而减少假阳性结果；另一方面推进新评价方法作为标准组合试验结果为阳性的化合物的后续选择。研究发现，假阳性结果主要来自II 相代谢酶活力不足的细胞系和p53 功能缺陷的细胞系，前者的解毒能力不足，后者DNA 修复功能较差。来自人源细胞（如人淋巴细胞、TK6 细胞和HepG2 细胞）的结果与传统的CHL、CHO 或V79 相比，特异性更佳[7]。此外，细胞毒性过大可导致假阳性结果，试验时需进行细胞毒性相关指标检测，以支持试验浓度设置的合理性。

近年来，随着替代毒理学的兴起和组织工程技术的应用，三维（3 dimensions， 3D） 重组人工皮肤模型在化妆品毒性替代模型的研发中崭露头角。3D 重组皮肤模型使用人来源的皮肤组织构建，试验周期较短，试验结果与人体毒性结果相比更具可比性和针对性。尽管目前研发的人体皮肤模型尚不包含毛囊、皮脂腺、神经、循环和淋巴系统，研究数据与人体临床试验数据的相关性还有待商榷，但极有可能在今后列入安全性评价指导原则或相关标准，在监管领域有重要前景。以下就人3D 重组皮肤模型在遗传毒性评价中的研究进展与应用前景进行阐释。

3D 重组皮肤模型在化妆品原料遗传毒性评价中的应用

皮肤是人类最大的器官，由多种类型的细胞共同构成阻挡有害物质进入机体的第一道天然屏障。首个体外表皮模型于20 世纪70 年代成功构建，其初衷是解决临床患者大面积皮肤损伤与缺失修复的瓶颈，之后逐渐应用于体外化妆品安全性评价[8]。3D 重组皮肤模型将人皮肤细胞培养于特殊的插入式培养皿后得到，具有完整的3D 皮肤解剖结构，从功能和结构上模拟人体皮肤，在化妆品毒性评价中具有重要价值。因此，难溶的、膏状和油脂类配方的受试物以涂抹的方式放到皮肤模型上，解决了体外试验中化妝品制剂性质特殊的问题。此外，3D 皮肤模型可以提供毒代动力学数据为毒理学数据分析提供支持。然而，因当前模型不包含毛囊、汗腺、皮脂腺等皮肤附属结构，且屏障功能低于真实皮肤，3D 模型试验中的经皮吸收率通常高于真实人群使用情况[9]。今后应着重研发与人体接近的、适合不同类产品评价需求的、稳定的、可长期重复给药的皮肤模型。

目前已应用于遗传毒性试验研究的商品化皮肤模型包括美国MatTek 的EpiDermTM 和Epi-200 和法国欧莱雅的EpiSkinTM。其中表皮模型主要用于微核试验，而全皮模型则更适用于灵敏度较高的彗星试验。

1. 微核试验

COLIPA 组织欧盟、美国及日本多家实验室开展基于EpiDermTM 的国际实验室间联合验证，通过试验方法标准化、已知毒性受试物小范围验证和大量受试物实验室间联合验证逐步确认试验方法及其复现性[10]。当前已完成29 个受试物的大规模验证结果发现EpiDermTM 的特异性达到88.1%，灵敏性达62.5%， 而一致性达到81%。比较EpiDermTM 和正常人表皮角化细胞对多种已知体内非遗传毒性及遗传毒性化合物的试验结果，发现受试物不经S9作用即可得到接近体内的研究结果，与此同时EpiDermTM也可较好地排除因毒性引起的体外培养细胞假阳性结果[11]。Hu et al 也使用EpiDermTM 对7 种化合物开展验证并指出该模型可实现接近体内研究的暴露条件，有效对染色体损伤风险作出预测[12]。近年来，EpiSkinTM 皮肤模型也陆续开展微核试验的验证工作，一项就17 种化合物的胞质分裂阻断法微核试验研究发现其用于评估化合物遗传毒性的特异性、准确性及一致性分别达到60～75%、83～85% 和76～82%，且72 小时长时间暴露于受试物的方式可有效提高遗传毒性物质的检出率[13]。中国EpiSkinTM皮肤模型微核试验方法已于我国完成初步验证，结果显示该模型的稳定性和细胞增殖活力可满足试验需求，并可确将阳性物质长春新碱、N- 乙基-N- 亚硝基脲、3-丁内酯、2-乙酰氨基芴和阴性物质环己酮、2，4- 二氯苯酚的遗传毒性进行归类，证明其具备一定预测能力，在今后将进一步验证并推广。MatTek 的Epi-200 皮肤模型也完成了历时7 年的微核试验联合验证[14]。美国和欧洲的4 个实验室对43个化合物的验证结果显示，与体内遗传毒性结果相比，该模型总体准确率为 80%，灵敏度为 75%，特异性为 84%；实验室间和实验室内的重现性分别为 77% 和 84%。 此外，72h 暴露方案比48h 更为灵敏。当前使用三D 皮肤模型微核试验数据作为化妆品安全性监管的资料已提交至欧洲替代方法验证中心（European Centre for the Validationof Alternative Methods， ECVAM）。

2. 彗星试验

彗星试验主要用于预测受试物的DNA 反应性，可与体外微核试验形成互补。COLIPA 已分阶段使用EpiDermTM 开展体外彗星试验实验室间联合验证工作。在第一阶段和第二验证的工作中分别使用甲磺酸甲酯、4-硝基喹啉、乙酰基亚硝基脲、2，4- 二氨基甲苯、硝基苯酚、环己酮等对模型进行验证，发现该模型的复现性较好。然而溶剂组背景值过高（高于30%） 成为进一步大规模验证的瓶颈。也有研究提示使用尚未发育完全的细胞模型EPI-201 可减少运输时长对皮肤模型质量的影响，从而降低背景值[15]。化妆品欧洲遗传毒性专项组（CosmeticsEurope Genotoxicity Task Force） 和德国联邦教育与研究部使用全皮模型如EpiDerm FT 或Phenion? FT研究使用其开展彗星试验的重复性和预测效力[16]。在Reisinger 等[16] 进行的验证研究中，使用丝裂霉素C、氯化镉、N- 乙基-N- 硝基脲、7，12- 二甲基苯并蒽、没食子酸丙酯、丁香酚、邻苯二甲酸二（2- 乙基己基） 酯、环己酮等8 种化学品在Phenion? 全层皮肤模型上进行验证，3D 皮肤彗星测定法显示出较高的预测能力以及良好的实验室内和实验室间可重复性。

Flamand et al，使用EpiSkinTM 研究洛美沙星的光遗传毒性，即模型涂抹洛美沙星并经紫外照射后再取皮肤组织开展彗星试验，验证只有洛美沙星涂抹与紫外照射同时存在时组织细胞的尾DNA 百分率显著性升高，提示其存在光遗传毒性。该结果与人体皮肤试验结果一致[17]，提示模型具有较好的代谢功能。我国研发的人源重建皮肤模型EpiKutis 也已使用盐酸氯丙嗪、盐酸异丙嗪、8- 甲氧基补骨脂和十二烷基硫酸钠建立了国产人源重建皮肤模型的体外光毒性试验方法[18]，为皮肤光毒性替代检测方法提供了新补充。

化妆品遗传毒性评价的决策思路

COLIPA 基于上述研究结果，提出以下化妆品遗传毒性评价的决策思路[6]。首先应根据已有的数据和资料，包括理化属性、暴露和代谢方式、遗传毒性及致癌性数据对化妆品原料的风险进行预判。在此基础上进行证据权重分析（weight of evidence，WoE），判断是否有足够数据支持化合物具有或不具有遗传毒性风险。如果当前数据足够作出判断，则进行风险评估分析，认为化合物具有遗传毒性或人体暴露后的致癌性风险极低，无需后续试验。如果当前数据不足以作出判断，则开展Ames 试验、体外微核试验/ 染色体畸变试验或哺乳动物细胞基因突变试验。体外试验结果均为阴性时，再次使用证据权重法进行分析并得到结论。如体外试验结果为阳性，需判断所选择的试验方法是否适宜及是否充分。

体外试验结果为阳性的第一种可能即Ames 试验结果为阳性，而体外微核试验/ 染色体畸变试验结果为阴性。此时，需进行哺乳动物基因突变试验。如hprt 基因突变试验为阴性，再结合Ames 试验阳性结果与哺乳动物试验体系的不相关性分析，可排除Ames 试验阳性结果带来的遗传毒性风险担忧。另一个方案是开展叙利亚仓鼠胚胎（Syrian hamster embryo，SHE） 细胞转化试验。该方法通过检测原代SHE 细胞形态变化，评价化合物的致癌性风险，试验结果与啮齿动物致癌性评价数据的一致性达到近80%[19]。含芳香胺化合物的染发剂通常在Ames 试验中得到阳性结果，但SHE 试验可以对存在致癌性的芳香胺和非致癌性的芳香胺进行准确的区分（结果准确率达到90%）[20]。它也可以对遗传毒性致癌性化合物（直接作用于機体遗传物质的致癌物） 和非遗传毒性致癌性化合物（不直接作用于机体遗传物质的致癌物） 进行区分。值得注意的是，因该方法涉及放射线的使用，其推广和普及受到了限制。此外，基于3D 皮肤模型的彗星试验也可以作为第三种选择。彗星试验有助于检测到广谱的DNA 损伤（包括基因突变和染色体损伤）。此外，可考虑Ames 试验结果为阳性是否与阈值有关。基于机体的保护性DNA修复机制，人体通常可容忍低水平DNA 损伤，如果实际暴露量低于某一阈值则致癌性风险可忽略。如研究发现烷化剂甲磺酸乙酯在体外和体内均存在作用阈值[21]。进行阈值分析时需结合暴露水平与阈值浓度进行评估。

体外试验结果为阳性的第二种可能即Ames 试验结果为阴性，而体外微核试验/ 染色体畸变试验结果为阳性。后续试验的首选方法是开展基于3D 皮肤模型的微核试验或彗星试验，然而该试验尚不能成为一个独立的系统，但作为常规体外微核和彗星试验的后续试验有助于证据权重评估[6]。此外，SHE 细胞转化试验和阈值分析也可作为备选后续评估方法。

体外试验结果为阳性的第三种可能即Ames 试验结果和体外微核试验/ 染色体畸变试验结果均为阳性。则需要根据前两种可能的后续试验选择考虑开展适当的试验进行验证[6]。

小结与展望

化妆品原料的遗传毒性风险应根据其本身的性质、结构和功能类似物的信息、代谢物等的现有数据或预测结果，以证据权重的方式做出评估。基于3D 皮肤模型的微核试验和彗星试验为骨髓和外周血暴露量较低的化合物的遗传毒性评价，提供了有价值的评价方法。对于局部涂抹类药物而言，如在标准遗传毒性试验组合中体外微核/ 染色体畸变试验中获得阳性结果，可考虑以3D 皮肤微核/ 彗星试验作为后续试验选择。应用3D 皮肤模型开展体外微核试验和彗星试验获得的数据与2D 培养条件下获得的结果相比，假阳性率更低，准确性更高。而基于3D 皮肤模型的彗星试验作为微核试验的重要补充，后续需对试验条件进行进一步优化。在体外替代评价方法大行其道的趋势下，如何优化体外遗传毒性评价试验条件及策略、验证3D 模型的代谢能力和确证该模型的可靠性，成为现阶段需着力攻克的重点。