纳米原料安全性的国际研究趋势（防晒篇）

张铮 陈琼 李璐 苏哲 王钢力 涂家生 尚靖 孙春萌

关键词：纳米原料；欧盟消费者安全科学委员会；安全评估；法规；发展趋势

纳米原料凭借其独特的尺寸、分散性以及抗氧化等各项优势，目前在化妆品行业的运用日益广泛[1， 2]。尤其是纳米二氧化钛（TiO2） 和纳米氧化锌（ZnO），它们是如今市面上防晒霜产品中占比最大的两种物理防晒剂。但正是由于纳米原料优异的尺寸以及表面性能，导致其在纳米尺度下表现出与常规物料截然不同的性质。例如高表面能、制剂稳定性、皮肤暴露风险等一系列问题。因此纳米原料的性质及使用安全性始终受到国际各方面的高度关注[3， 4]。

其中，欧盟消费者安全科学委员会（ScientificCommittee on Consumer Cafety，SCCS） 在纳米原料安全评估方面始终保持积极态度。SCCS 于2019 年发布一项《化妆品纳米原料安全评价指南》（SCCS/1611/19）[5]，提出以暴露为导向的安全评估策略，采用与常规物质（非纳米） 相同的原则进行。针对化妆品纳米原料，国际化妆品监管合作组织（International Cooperation on CosmeticsRegulation， ICCR） 也持续成立专项工作组，就相关问题组织多项专题讨论与研究，并发布一系列技术性文件[6]。

01纳米原料的安全性评估现状

在2019 年最新发布的《化妆品纳米原料安全性评价指南》[5] 中，SCCS 对化妆品中纳米原料的安全性评估方法进行了新阶段的讨论。它不仅是对于纳米原料相关领域最新研究成果的更新，还新增了有关、涂层、载体、免疫毒性等新型风险评估模式的讨论。而ICCR 对化妆品纳米原料的安全性评估方法也进行了相关讨论[7]。与SCCS 类似，它也是提出一项以暴露为导向的安全评估策略，采用与常规物质（非纳米） 相同的原则进行，逐一讨论纳米原料的一般安全性、理化特征、暴露风险评估、危害识别和特征描述以及风险描述。

1.1 暴露风险评价

在所有纳米粒子的体内/ 外透皮性能研究中报道最多的要数物理防晒剂纳米TiO2 和ZnO。实际上，早在2000 年欧盟化妆品和非食品科学委员会（ScientificCommittee on Cosmetic and Non-food Products，SCCNFP）就已经发布了一份有关纳米TiO2 的意见书[8]，其中总结了100 多项有关体外（人、猪皮）或体内（大鼠、人体皮肤活检） 研究结果。绝大多数实验结果表明，微米或纳米尺寸的TiO2 颗粒仅能滞留在皮肤表面或角质层（SC） 外层，并不会渗透进入活性皮肤中，甚至穿透人体皮肤产生全身暴露风险[9]。为此SCCNFP 于同年通过了有关纳米TiO2 最高可添加25% 作为化妆品中的紫外线过滤剂的安全性意见。

1.1.1 经皮暴露途径

由于这项科学意见牵涉化妆品中物理防晒剂的使用，不久后SCCS 就开展专项审查工作，考察异常皮肤状况（如SC 剥离、UVB 损伤、炎症皮肤） 对纳米TiO2 皮肤渗透性能的影响。Senzui 等[10] 考察了四种不同类型的纳米TiO2分别对尤卡坦小型猪完整、SC 剥离和脱毛皮肤的体外渗透性能。实验结果显示，在完整和SC 剥离的皮肤中，无论纳米TiO2 是何种类型，均未观察到皮肤渗透现象。

Monteiro 等[11] 利用紫外线对约克郡猪进行照射，从而获得UVB 损伤皮肤模型。随后对自制含纳米TiO2、ZnO 的防晒霜进行体内/ 外经皮渗透性能的考察。体外透皮实验TEM 扫描结果显示，TiO2 粒子最多穿透至SC 第17 層，而ZnO 则停留在皮肤的表面。通过ICP-MS 分析接收液，并未检测到有任何Ti、Zn 元素，证明并没有纳米粒子穿透皮肤屏障。体内透皮实验结果也与体外保持一致，通过SEM 电镜观察到纳米粒子大多以团聚物的形式滞留在皮肤表面和毛囊的根部。整体来说，纳米TiO2 和ZnO对于UVB 损伤皮肤的渗透性能略微增强，但是目前还没有观察到有透皮吸收的风险。

诸如上述对于纳米TiO2、ZnO 的透皮性能考察不胜枚举，几乎所有在人类/ 动物中进行的体外或体内透皮研究均表明，纳米TiO2 的渗透强度仅局限于SC，在皮肤中的暴露量十分有限。于是SCCS 在2014 年发布关于纳米TiO2 的安全性评估[12] 并得出结论：目前已有的实验证据表明，Ti O2 纳米颗粒的透皮吸收性能较差，使用浓度高达25% 的纳米TiO2 作为防晒霜中的紫外线过滤器也不会对人类（健康、完整或晒伤的皮肤） 造成任何不良影响。

1.1.2 吸入暴露途径

虽然市面上大部分防晒霜和其他提供紫外线防护的化妆品都是通过直接涂抹皮肤来使用的。但还有部分产品以喷涂方式应用，这就可能导致消费者肺部发生纳米TiO2 的吸入暴露风险[13]。

Eydner 等[14] 使用纳米TiO2 对雌性Wistar 大鼠进行了为期3 周的体内吸入研究。通过组织病理学检测，观察到大鼠肺部发生了细微的炎症变化。虽然通过相对沉积指数（RDI） 的计算发现，在毛细血管中存在少量的纳米颗粒，但是并没有观察到明显的血液易位行为。在其他几项有关吸入暴露纳米TiO2 的毒代动力学研究中[15， 16]，纳米TiO2 确实存在穿透肺屏障发生易位的情况，在肝脏、心脏、肾脏、胰腺、脾脏、脑或血液中均检测出了纳米颗粒，但是易位程度和易位量十分有限，毕竟易位速率明显比肺清除速率更慢。

由于SCCS 的意见只涉及纳米TiO2 的皮肤应用，于是又另外发布了一则声明：不建议将纳米TiO2 以喷雾制剂的形式应用到化妆品中，它可能会导致肺部发生吸入暴露风险[13]。根据这一意见，欧盟化妆品法规规定最高添加25% 的纳米TiO2 作为紫外线过滤器，喷雾产品除外。

1.2 毒理学评价

通常情况下，传统尺寸的纳米TiO2 和ZnO 被认为是无害的。但是当它们的尺寸缩小到纳米级别时，由于理化性质、化学反应性和光催化活性的改变，纳米颗粒与生物分子之间的相互作用可能会大幅增强[17]。大量实验研究表明，Ti O2 纳米颗粒固有细胞毒性的增加，主要是由氧化应激和细胞膜破坏所导致的[18]。另外，Watson[19] 通过彗星实验考察了ZnO 纳米颗粒对TK6/H9T3 的细胞毒性影响。研究结果表明，ZnO 粒子对两种细胞系存在明显的DNA 损伤和细胞毒性作用，并且呈现剂量依赖性。其他有关纳米TiO2 通过不同途径发生暴露的毒性研究发现，暴露部位均产生了不同程度的病理损伤。如吸入暴露，肺部便会出现类似石棉引起间皮瘤样的细胞损伤，进而可能导致肺部肿瘤[17]。

为此，欧洲化学品管理局（European ChemicalsAgency， ECHA） 于2017 年6 月9 日宣布：“现有科学证据符合分类、标签和包装法规（Classification Labeling andPackaging， CLP） 的标准，将钛白粉（二氧化钛或TiO2）列入怀疑通过吸入可能引起癌症的物质。” 同一时间段，美国化学学会（American Chemical Society， ACS） 也于同年3 月宣布[20]：“根据人类和动物的科学研究发现，纳米颗粒可以从肺部进入血液，到达心血管系统的易感区域，在那里它们可能会增加心脏病发作或中风的可能性。” 澳大利亚政府与工业、创新、气候变化、科学、研究和高等教育部均一致认为，纳米颗粒的毒性可能比其他材料更大。

1.3 光毒理学评价

对于纳米TiO2 和ZnO 这类紫外屏蔽剂来说，还存在另一个不容忽略的问题，即当暴露于紫外线辐射时，他们有可能会产生一类被称为活性氧（ROS） 的自由基，包括羟基自由基、超氧化物阴离子和单线态氧等。众所周知，这类自由基会导致各种各样的氧化损伤[21]。Rampaul等[22] 通过亚甲基蓝探究不同涂层的纳米TiO2 和ZnO的光催化活性。研究表明，表面经过有机硅烷或聚二甲基硅氧烷处理的TiO2 纳米粒（锐钛矿/ 金红石混合晶型）具有极强的光催化活性，对MDCK-（1 犬肾上皮）、Pt K2（袋鼠肾上皮） 和HaCaT（人皮肤上皮） 细胞都变现出非常严重的细胞毒性。与空白组比较，死亡率增加了2 ～ 4.9 倍。相比之下，带有氧化铝或锰涂层的纯金红石型TiO2 颗粒要显得更为安全，几乎没有发生光降解。另外值得注意的是，纳米ZnO 自身也会产生一定的自由基，甚至在某些條件下，由于ZnO 的存在，TiO2 的光催化活性还会进一步提高。后来Tiano[23] 通过考察经过表面修饰的TiO2颗粒在UVA 照射条件下对人体成纤维细胞的影响，进一步证实了上述结论。实验结果显示，纯锐钛矿型或与金红石型混合的TiO2 颗粒，无论表面是否涂覆涂层，都具有高度的光催化活性。或许这就是包括防晒霜在内的化妆品大多采用金红石型的纳米TiO2 的原因。

02纳米原料的风险考量

2016 年，按照《欧盟化妆品法规1223/2009》[24]要求，欧盟公布了一项较为完整的市场上化妆品所用纳米原料的目录。由于存在大量不确定数据，因此不断修订，目前最新版本发布于2019 年11 月。该目录中主要收录了4 种纳米原料用作化妆品中的防晒剂组分，分别是三联苯基三嗪[25]、氧化锌[26]、二氧化钛[27] 和亚甲基双- 苯并三唑基四甲基丁基酚[28]。

2.1 三联苯基三嗪

根据SCCS 最新修订的意见书（EU No.886/2014），将10% 的纳米三联苯基三嗪（初始粒径≥ 80 nm，纯度≥ 98%，无涂层） 作为化妆品中的防晒剂使用时，可认为其经皮使用不存在风险性。但在进行风险评估时，考虑到存在吸入性暴露，且存在较多的不确定性导致无法得出10% 三联苯基三嗪是否可以在喷雾产品安全使用。因此，SCCS 认为如果不能提供更多关于反复吸入后的安全性信息，则禁止将三联苯基三嗪应用于喷雾类产品中。

2.2 氧化锌

早在2003 年，化妆品及非食品类产品消费者科学委员会（Scientific Committee on Cosmetic Products andNon-food Products intended for Consumers， SCCPNP）就发表了关于ZnO 安全性的观点。SCCPNP 认为：通常情况下，ZnO 被认为是一种非毒性物质，包括用于化妆品时。但是，由于并没有考虑ZnO 潜在的吸入暴露风险，后来的消费产品科学委员会（Scientific Committee forConsumer Products， SCCP） 又对微粒化ZnO 的安全性提出担忧。在SCCP 后续发表的观点中，SCCP 认为非纳米型ZnO 以25% 的最大浓度用于化妆品时是安全的，但对于纳米型ZnO 的风险评估，仍需要提供进一步的数据支持。

因此，SCCS 又分别于2012 年、2013 年发表了关于纳米ZnO 的安全评估观点。SCCS 认为，基于现有的证据，特定条件的纳米ZnO 以25% 的最大浓度、作为防晒剂施用于人体皮肤时，并不会引起不良反应。此外，SCCS 还认为没有证据表明ZnO 纳米颗粒能够通过皮肤或口腔途径吸收，且通过安全边际（MoS） 计算所得的结果也是可以接受的。但是，根据现有信息，SCCS 认为ZnO 纳米颗粒用于喷雾型产品是不安全的，其主要原因是潜在的吸入风险。

因此，基于上述SCCS 的观点，欧盟委员会于2016年4 月21 日发布修订法规（EU No.621/2016），认为纳米ZnO 可以在化妆品中作为防晒剂使用，最大使用浓度为25%，但不得应用于吸入类型的产品中，以防消费者因吸入而导致肺部暴露风险。

2.3 二氧化钛

2013 年7 月，SCCS 发布一项科学说明。当符合指定规格且使用浓度不超过25% 时，纳米TiO2 作为防晒剂用于健康、完整或晒后皮肤时，并不会产生健康风险或不良反应。此外，考虑到并无系统性暴露，SCCS 认为通过皮肤使用纳米TiO2 并不会给消费者带来显著风险。但是，SCCS 对于纳米TiO2用于喷雾型产品的安全性感到担忧，主要集中于可能通过吸入产生肺部暴露。

另外，SCCS 注意到纳米原料显著的光催化活性不仅会对暴露的皮肤产生局部影响，而且沉积在毛囊或汗腺中的光活性納米颗粒可能会带来长期威胁。因此SCCS 明确指出“化妆品中使用的纳米材料理想情况下应为非光催化材料”，并于2015 年发布了关于纳米Ti O2 防晒霜配方的新指南[29]。六项关键性建议中有三项是针对TiO2 的材料本身：纳米TiO2 主要由金红石型或不超过5% 锐钛矿的金红石型组成；纳米TiO2 在最终制剂中对光照稳定；纳米TiO2 不具有光催化活性。

根据上述SCCS 的意见，欧盟委员会于2016 年7 月13 日发布修订法规（EU No.1143/2016）。在欧盟化妆品法规附录Ⅵ（防晒剂列表） 中添加了纳米级二氧化钛，且规定其最大使用浓度为25%，并对其理化特性（如纯度≥ 99%；金红石型或不超过5% 锐钛矿的金红石型；中位粒径≥ 30nm 等） 进行了限制。该项纳米级二氧化钛，不得用于可能吸入肺部的产品。

2.4 亚甲基双- 苯并三唑基四甲基丁基酚（MBBT）

SCCS 于2015 年3 月25 日发表一项研究说明：对于符合一定规格的MBBT 纳米颗粒，当以最高10% 的浓度用作防晒剂，以涂抹于皮肤的方式，施用于健康的、完整的皮肤以及受损的皮肤时，均不会对人体健康产生威胁。与另外三种防晒剂一样，纳米形式的MBBT 并不适用于可能通过吸入而增加肺部暴露量的使用形式。

根据SCCS 的观点，同时考虑到科学技术的进步，欧盟委员会于2018 年6 月20 日发布法规修订案（EUNo.885/2018），在《化妆品法规1223/2009》附录Ⅵ中添加了纳米级MBBT，并规定其最高使用浓度为10%，不得用于可能导致消费者发生肺部吸入风险的产品形式。

03安全研究相关技术手段

3.1 暴露风险

SCCS 认为，暴露风险的评估和潜在暴露途径的确定是纳米原料安全性评估的第一个关键决策点。这主要是因为通过机体暴露情况可以确定是否存在系统暴露风险。

值得注意的是，纳米原料的应用形式、剂量和暴露场景都需要最大限度地模拟人体使用的真实情况。因为消费者在最终使用时，纳米粒可能并不同于在实验室中建立的纳米特征（例如稳定的颗粒尺寸分布）。而对于给药剂量，除了基于质量的纳米颗粒浓度外，还应根据颗粒数量、尺寸分布和表面积来计算浓度。以此来平衡暴露期间纳米粒子因为聚集/ 降解/ 溶解所产生的影响。

纳米原料对应的检测方法也得较为成熟，需要有良好的准确度和重复性，检测限也必须得足够低，低至足以证明没有潜在的暴露风险。而EM 方法正具备这种灵敏度，可直观确认被吸收的纳米粒是否以纳米颗粒的形式存在于接收液或组织中。

3.2 危害识别与特征描述（剂量反应关系）

在毒理学评价中，纳米粒的某些特性可能会因与周围介质的相互作用而发生变化。因此，需要重点考察测试时的纳米粒是否与处方中的组成形式保持一致[30]。另外在应用剂量方面也需要特别注意，因为纳米颗粒的浓度在测试过程中可能会由于沉降或与器皿间的黏附而降低。因此，确定纳米粒在测试介质中的稳定性和均匀性是很重要的，以此确保在测试期间维持所施加的浓度/ 剂量。

对于体外遗传毒性评估，应评估染色体损伤和基因突变程度。通常使用的细菌反向突变（Ames） 实验并不认为适合用于纳米粒的诱变性评估。由于细菌细胞壁的阻碍，细菌对纳米粒的吸收非常有限甚至根本无法摄取[31]。因此纳米粒子的内化效应不太可能像在哺乳动物细胞中观察到的那样发生，因此该检测方法的敏感性较差[32]。SCCS建议对纳米粒进行以下体外遗传毒性试验：哺乳动物细胞染色体畸变/ 致裂性试验（体外染色体畸变试验或微核试验）。微核试验可以使用单核或细胞分裂阻断方法进行。

04发展趋势

由于欧盟禁止对化妆品成分/ 产品进行动物实验，ICCR 对于新兴纳米原料的安全性评价变得更加困难，需要使用经过验证的替代方法来代替传统的动物实验。ICCR 明确规定，基于已知的纳米材料安全评估信息来进行外推或类比，这种方法是不可取的。但是纳米材料的总体风险特征是可以参考传统材料的。这不光是非纳米和纳米形式之间，也可以是同一纳米材料的不同纳米形式之间进行毒性数据的推断（桥接毒性方法）。例如短期毒性研究中类似的毒性特征、遗传毒性或ADME 的研究结果。如果纳米原料实际上与传统材料存在较大出入，那么就有必要对纳米原料的表征方法进行开发验证，在最终制剂、局部和系统暴露期间进行毒理学评估。还需要开发并验证能够真实模拟体内情况的体外模型，从而确定关键参数，完善预测机制，精准预判纳米原料理化性质、生物动力学行为以及毒理学结果。

而欧盟自身也积极推进符合“3R” 原则（减少、替代和优化） 的替代方法的开发与验证，《化妆品纳米原料安全性评价指南》（SCCS/1611/19） 中，逐项讨论了纳米原料毒理学替代方法的建立与运用。例如，体外和离体模型、计算机建模和分类处理方法[33]、基于生理的药代动力学（PBPK）[34] 或毒性动力学（PBTK） 建模方法[35]。但是目前大部分已通过证实的替代方法尚未通过用于纳米原料的相关验证，无法取代纳米粒的标准化体内毒理学评估方法[36]。因此这些新兴方法的可行性还需要一定的案例研究来进行科学论证。

05结语

纳米原料因其尺寸的特殊性，与传统物料相比具有完全不同的理化特征、表面特性和生物学特征，因此有关纳米原料的安全性一直是世界各国的重点关注对象。其中纳米形式的TiO2 和ZnO 已经作为最为常用的物理防晒剂在防晒产品中大量使用，这不禁引起了各机构的担忧。大量有关人体/ 动物的体内外透皮研究表明，无论是在健康的皮肤中还是在受损的皮肤中，纳米TiO2 或ZnO 都不会渗透到SC 以外的活性细胞中，更不可能进入全身血液循环。ICCR 与SCCS 也一致认为纳米TiO2 是一种非敏化剂，对皮肤无刺激性，并得出结论：没有证据表明皮肤接触纳米TiO2 后具有致癌性、致突变性或生殖毒性。因此欧盟委员会规定纳米TiO2 和ZnO 在防晒产品中的最大使用浓度为25%。但是禁止以喷雾形式应用于化妆产品中，以防消费者因吸入纳米颗粒而发生肺部暴露风险。

2021 年，我国《化妆品监督管理条例》正式施行，在配套的《化妆品注册备案资料管理规定》《化妆品新原料注册备案资料管理规定》中，首次提出了化妆品纳米原料相关要求。与此同时，为了规范化妆品的安全评估工作，国家药监局又组织起草了《化妆品安全评估技术导则（2021 版）》[37]，其中详细描述了化妆品原料的安全评估细则。虽然纳米形式的原料并没有提及，但是这对于将来纳米原料的安全性评估也具有一定的奠基作用。

这些都意味着我国对于化妆品行业中纳米原料的使用和管理将进一步规范[38]。这也对行业内部的相关科研工作者提出新要求，需要对相关领域的国际审查动态和最新研究进展进行持续跟进，不断健全和完善属于中国自己的化妆品纳米原料安全监管体系。