雀异黄酮对甲基苯丙胺诱导的神经细胞损伤保护作用及氧化应激机制研究

孙晓虹, 葛小霞, 阿力木·吾甫尔

(新疆医科大学第一附属医院1健康管理中心, 2神经内科, 乌鲁木齐 830054)

甲基苯丙胺(Methamphetamine,METH)是脂溶性苯丙胺类精神兴奋剂,易透过血脑屏障损伤中枢神经系统,长期滥用METH可导致幻听、幻视、焦虑、抑郁等行为及精神障碍,滥用人群低龄化,对社会具有一定的危害性[1-2]。目前有关METH神经毒性作用机制尚未完全阐明,临床仍缺乏有效防治药物。金雀异黄酮(Genistein,GEN)提取自大豆、小麦、玉米等植物,是大豆异黄酮的主要成分,约占大豆异黄酮总含量的60%,在抑制细胞凋亡、减少神经炎症等方面有重要作用[3]。林志军等[4]研究显示,GEN可有效抑制心肌细胞缺血再灌注模型的氧化应激损伤,发挥保护作用。目前关于GEN对METH诱导的神经细胞损伤的影响及其作用机制尚不清楚。有研究表明,METH诱导的神经细胞损伤与氧化应激关系密切[5],GEN能否通过氧化应激途径修复神经细胞损伤尚不可知,因此本研究探寻GEN对METH诱导的神经细胞损伤及氧化应激的影响及可能的机制,为临床防治METH神经毒性提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系PC12细胞(北京百欧博伟生物技术有限公司);GEN,纯度>98%(上海阿拉丁生化科技股份有限公司,C1431128);甲基苯丙胺,纯度≥99.8%(北京北方伟业计量技术研究院,107762);阿立哌唑口腔崩解片(成都康弘药业集团股份有限公司,国药准字:H20041501);DMEM培养基(3-2020)、四唑盐(MTT,0793-5G)均购自美国Sigma公司;AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡试剂盒(上海抚生实业有限公司,FS-79505);超氧化物歧化酶试剂盒(SOD,FT-D23758)、丙二醛试剂盒(MDA,BC0025-100)均购自上海梵态生物科技有限公司;活性氧(ROS)含量测定试剂盒(上海将来实业股份有限公司,YT6089);兔抗鼠B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2,Ab32124)、核因子E2相关因子2(Nrf2,Ab137550)、血红素加氧酶-1(HO-1,Ab13248)均购自美国Abcam公司。兔抗鼠Bcl-2相关X蛋白(Bax)一抗(K001593P)、HRP标记山羊抗兔二抗(K006153P)均购自亚科因(武汉)生物技术有限公司。CO2培养箱(日本sanyo公司,NHD DYE1738型);Elx800酶标仪(美国Thermo公司,HSG9832型);流式细胞仪(美国贝克曼库尔特公司,CytoFLEX SRT型)。

1.2 方法

1.2.1 细胞分组及处理 用含10%灭活胎牛血清(FBS)、青链霉素的DMEM培养基培养PC12细胞,培养条件:37℃、5%CO2、95%饱和湿度。取对数生长期的PC12细胞,以2.5×105/mL密度接种于24孔板,待融合80%左右时,更换无FBS的培养基,并随机分为5组,每组设6个复孔。空白对照组PC12细胞不做任何处理,用无FBS培养基继续培养24 h;METH组用终浓度为3 mmol/L METH溶液[6]的无FBS培养基继续培养24 h;GEN低、中、高剂量组用终浓度为1、10、100 μmol/L GEN溶液[7]处理细胞后,置于终浓度为3 mmol/L METH溶液的无FBS培养基继续培养24 h;阳性对照组用含终浓度为20 μmol/L阿立哌唑溶液[3]处理细胞后,置于终浓度为3 mmol/L METH溶液的无FBS培养基继续培养24 h。所有实验重复6次。

1.2.2 MTT法检测细胞增殖能力 将细胞以2.5×105/mL密度接种至24孔板,继续培养24 h,各孔加MTT(20 μL,5 g/L),继续培养4 h后,加入5 mg/mL浓度的二甲基亚砜溶液150 μL,振荡、溶解。测定490 nm处各孔细胞光密度值(OD490 nm),细胞存活率即为各试验孔OD值占空白对照组OD值的百分比。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡率 收集各组细胞,按照凋亡试剂盒说明书,以5 μL碘化丙啶(PI)+5 μL异硫氰酸荧光黄(AnnexinV-FITC)双染试剂,避光孵育20～25 min、稀释后,1 h内上机检测,仪器读取凋亡率数值。

1.2.4 ELISA检测氧化应激水平 收集各组细胞及上清液,加入裂解液后立即根据ROS试剂盒说明书检测待测样本ROS含量;取上清8 000 r/min,离心15 min,采用SOD、MDA试剂盒检测待测样本SOD、MDA含量。

1.2.5 免疫印迹法检测Nrf2/HO-1通路相关蛋白表达情况 收集各组细胞,裂解,提取总蛋白,行电泳,转膜,加入封闭液25℃封闭2 h,加入一抗Nrf2(1∶500)、HO-1(1∶500)、Bcl-2(1∶500)、Bax(1∶500)、内参β-actin(1∶500),4℃过夜,加入HRP标记二抗(1∶1 000稀释),25℃孵育1.5 h,显影、定影,计算目的蛋白与内参β-actin的相对表达量。

2 结果

2.1 各组PC12细胞增殖情况比较与空白对照组比较,METH组PC12细胞存活率降低(P<0.05);与METH组比较,GEN低、中、高剂量组及阳性对照组PC12细胞存活率升高(P<0.05);与阳性对照组比较,GEN低、中剂量组PC12细胞存活率降低(P<0.05),GEN高剂量组PC12细胞存活率差异无统计学意义(P>0.05);PC12细胞存活率呈剂量依赖性升高(P<0.05),见表1。

表1 各组PC12细胞增殖抑制率比较

2.2 各组PC12细胞凋亡情况比较与空白对照组比较,METH组PC12细胞凋亡率升高(P<0.05);与METH组比较,GEN低、中、高剂量组及阳性对照组PC12细胞凋亡率降低(P<0.05);与阳性对照组比较,GEN低、中剂量组PC12细胞凋亡率升高(P<0.05),GEN高剂量组PC12细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05);PC12细胞凋亡率呈剂量依赖性降低(P<0.05),见图1、表2。

注:A,空白对照组;B,METH组;C,GEN低剂量组;D,GEN中剂量组;E,GEN高剂量组;F,阳性对照组。图1 各组PC12细胞凋亡情况比较

表2 各组PC12细胞凋亡情况比较

2.3 各组PC12细胞氧化应激水平比较与空白对照组比较,METH组PC12细胞SOD活性降低,MDA含量、ROS水平均升高(P<0.05);与METH组比较,GEN低、中、高剂量组及阳性对照组SOD活性升高,MDA含量、ROS水平降低(P<0.05);与阳性对照组比较,GEN低、中剂量组SOD活性降低,MDA含量、ROS水平升高(P<0.05);GEN高剂量组SOD、MDA、ROS差异无统计学意义(P>0.05);SOD活性呈剂量依赖性升高,MDA含量、ROS水平呈剂量依赖性降低(P<0.05),见表3。

表3 各组PC12细胞氧化应激水平比较

2.4 各组PC12细胞凋亡蛋白表达比较与空白对照组比较,METH组Bax蛋白水平升高,Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05);与METH组比较,GEN低、中、高剂量组及阳性对照组Bax蛋白水平降低,Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05);与阳性对照组比较,GEN低、中剂量组Bax蛋白水平升高,Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05),GEN高剂量组Bax、Bcl-2蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05);Bax蛋白水平呈剂量依赖性降低,Bcl-2蛋白水平呈剂量依赖性升高(P<0.05),见表4。

表4 各组PC12细胞凋亡蛋白表达比较

2.5 PC12细胞Nrf2/HO-1通路蛋白表达比较与空白对照组比较,METH组PC12细胞Nrf2、HO-1蛋白水平降低(P<0.05);与METH组比较,GEN低、中、高剂量组和阳性对照组Nrf2、HO-1蛋白水平升高(P<0.05);与阳性对照组比较,GEN低、中剂量组Nrf2、HO-1蛋白水平降低(P<0.05),GEN高剂量组Nrf2、HO-1蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05);Nrf2、HO-1蛋白水平呈剂量依赖性升高(P<0.05),见表5。

表5 各组PC12细胞Nrf2/HO-1通路蛋白表达比较

3 讨论

METH俗称"冰毒",无色、无臭,属于苯丙胺类中枢神经兴奋剂。METH极易透过血脑屏障并选择性作用于中枢神经系统损害中枢神经,造成幻听、幻视等精神分裂阳性症状及冲动、焦虑等,给滥用者身体及精神造成严重伤害,甚至造成刑事犯罪,危害社会公共安全[8]。阿立哌唑属于脂溶性喹诺啉酮类衍生物,是一种抗精神病药物。研究显示,阿立哌唑对神经细胞损伤具有保护作用,但也具有一定的副作用[9]。因此寻找有效且副作用少的戒毒药物具有重要社会意义。GEN是一种三羟基异黄酮,其在细胞缺血再灌注损伤修复、氧化应激调控中的作用日益受到关注[10]。研究显示[11],GEN对叔丁基过氧化氢诱导的心肌细胞H9c2衰老模型有显著的保护作用,其机制与提高细胞的抗氧化能力有关。高华武等[12]研究发现,GEN可通过调控钙离子通道相关蛋白表达,促进海马神经元损伤修复进程。引发神经元细胞凋亡是METH神经毒性作用机制之一[13]。多项研究证实,Bcl-2和Bax参与脑神经细胞损伤,且可受机体内的ROS、DNA损伤等氧化应激因素刺激,使Bax与Bcl-2表达失衡,参与调控神经细胞凋亡[14-15]。本研究以不同剂量GEN处理后,PC12细胞存活率升高,凋亡率降低,且Bax蛋白下调,Bcl-2蛋白上调,且具有剂量依赖性,高剂量组与阳性对照组无差异,说明GEN可能促进METH诱导的PC12细胞增殖并抑制细胞凋亡,对神经细胞损伤发挥保护作用。

多巴胺神经元氧化应激损伤可能是METH细胞毒作用机制之一[16]。本研究以不同剂量GEN处理后,PC12细胞SOD活性升高,MDA、ROS水平降低,呈剂量依赖性。SOD与MDA水平可间接反映细胞氧化应激损伤程度[17-18]。龚晓康等[19]研究显示,METH可促进小鼠脑区氧化应激损伤学习记忆,其在动物体内水平的研究结果与本研究一致。说明GEN可能通过抑制METH诱导的氧化应激损伤,进而促进PC12细胞增殖并抑制凋亡。范勇等[20]研究发现,GEN可通过调控海马神经元自噬水平保护创伤应激障碍大鼠神经损伤,但具体机制尚不明确。Nrf2是一种抗氧化剂,当氧化应激信号刺激组织器官时,Nrf2转移至细胞核与下游的多效靶基因相结合发生转录反应,产生HO-1、SOD等抗氧化物酶,能够有效清除细胞内的氧自由基,进而抑制细胞氧化应激损伤导致的细胞凋亡[21]。林斯革等[22]研究显示,促进Nrf2/HO-1通路活化可对脑缺血再灌注后神经元损伤发挥保护作用。本研究以不同剂量GEN处理后的PC12细胞Nrf2、HO-1蛋白水平升高,呈剂量依赖性,高剂量组与阳性对照组无差异。说明GEN能促进METH诱导的PC12细胞增殖并抑制细胞凋亡,对神经细胞发挥保护作用,可能是通过促进Nrf2/HO-1通路活化抑制氧化应激损伤实现的。

综上所述,GEN能促进METH诱导的PC12细胞增殖并抑制细胞凋亡,可能对神经细胞发挥保护作用,且可能与促进Nrf2/HO-1通路活化抑制氧化应激损伤有关。然而本研究并未能明确Nrf2/HO-1通路在METH诱导的PC12细胞损伤中的具体作用机制,后期有待进一步研究。