人前体脂肪细胞分化过程及肥胖人群脂肪组织中hsa_circ_0017650高表达

张 晶，吴 凯，黄 伟*

1.武汉市普仁医院 武汉科技大学附属普仁医院 内分泌科，湖北 武汉 430081；2.武汉市青山区厂前街社区卫生服务中心 内科，湖北 武汉 430081

肥胖是指体内脂肪过多积累的一种状态,肥胖者脂肪层较厚,体质量明显超标。肥胖者一般摄入能量过多,机体代谢改变,引发一系列生理、病理改变,是Ⅱ型糖尿病、高血压和心血管疾病等发生的危险因素,对患者健康造成严重影响[1-2],因此,肥胖相关机制的探讨是研究热点。肥胖与白色脂肪的存在密切相关,体内过多的能量均靠白色脂肪存储,减少白色脂肪含量是减肥的有效手段[3]。环状RNA(circular RNA,circRNA)是非编码RNA中的一种,广泛存在于真核生物细胞内,稳定性强,参与营养物质合成以及代谢过程。多项研究显示,其在脂质分化中发挥作用[4-5]。通过circRNA微列阵检测内脏脂肪组织与脂肪细胞中circRNA表达谱,发现hsa_circ_0017650差异表达[6],并经RT-qPCR验证此结果。CircRNA可招募miRNA来调节靶基因的表达。研究显示,miR-370在脂肪酸代谢中发挥作用[7]。生物信息网站分析显示,hsa_circ_001765与miR-370存在靶关系。因此,初步认为hsa_circ_0017650在肥胖患者脂肪组织中发挥调控作用。基于此,本研究拟分析hsa_circ_0017650与肥胖的相关性,旨在为hsa_circ_0017650在肥胖患者中发挥的作用机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞及病例:人前体脂肪细胞系(3610)(宁波明舟生物科技有限公司);病例:武汉市普仁医院外科2017年9月至2019年9月期间行阑尾手术的患者125例。

1.1.2 试剂及试剂盒:地塞米松(上海源叶生物科技有限公司);3-丁基-1-甲基次黄嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine,IBMX)和胰岛素(Sigma-Aldrich公司);油红O染料、反转录试剂盒和PCR试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)。C/EBPα、FABP4/ap2和LPL基因引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司设计。

1.2 方法

1.2.1 患者的分组情况:将体质指数(body mass index,BMI)高于24 kg/m2患者纳入肥胖组,BMI在18～24 kg/m2范围内人群纳入对照组[8]。肥胖组53例,对照组72例。排除高血压、糖尿病、心脑血管疾病、恶性肿瘤患者。阑尾手术过程中取患者腹膜后脂肪组织迅速置于液氮中,然后移至-80 ℃冰箱中冷冻保存待测。此研究经武汉市普仁医院伦理批准(2017-053)及受试者知情同意并签署知情同意书。

1.2.2 人前体脂肪细胞的培养及分化诱导:将细胞接种于6孔板(细胞为1×105个/mL),添加完全PAM培养基,置于CO2培养箱中培养(CO2浓度为5 %,温度设置为37 ℃),待细胞单层汇合后,更换培养基为添加0.5 mmol/L的IBMX+1 μmol/L地塞米松+5 μg/mL胰岛素的DMEM培养基,4 d后更换为含1 %青链霉素与5 μg/mL胰岛素的DMEM培养基,培养细胞至分化成功。收集此过程中第0、1、3、5、7、9、12天时的细胞样品,通过RT-qPCR检测各个时间点细胞hsa_circ_0017650,每个时间点均设置6个复孔。

1.2.3 油红O染色以及RT-qPCR观测脂质形成:收集诱导过程中第0、6、12天时的细胞样本,弃培养基,PBS清洗,甲醛固定,蒸馏水漂洗,油红O试剂盒染色,镜下观察细胞脂滴形成情况,拍照保存。

RT-qPCR检测CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)、脂肪酸结合蛋白(FABP4/ap2)和脂蛋白脂酶(LPL)等3种白色脂肪基因表达水平,判断脂肪细胞是否分化成熟。C/EBPα、FABP4/ap2和LPL引物序列(表1)。具体操作方法参见1.2.4。

表1 C/EBPα、FABP4/ap2和LPL引物序列

1.2.4 RT-qPCR检测各时间点前体脂肪细胞以及患者腹膜后脂肪组织hsa_circ_0017650的表达:用Trizol试剂提取人前体脂肪细胞及患者腹膜后白色脂肪组织中RNA,将RNA反转录为cDNA。按PCR试剂盒说明书中的反应体系加样。Hsa_circ_0017650与内参重组人核糖体磷蛋白P0(recombinant human ribosomal phosphoprotein P0,RPLP0)的引物序列由上海生工设计(表2),反应条件:95 ℃预变性10 min;95 ℃变性15 s、60 ℃退火1 min,72 ℃延伸30 s,40个循环,采用2-△△Ct法计算人前体脂肪细胞及患者腹膜后脂肪组织中hsa_circ_0017650相对表达量。

表2 Hsa_circ_0017650及内参引物序列

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 人前体脂肪细胞的分化鉴定

随着时间的延长,人前体脂肪细胞由梭形变为椭圆形或圆形,体积逐渐增大,第零天时不着色,第6天时可见少量橘红色脂肪滴,第12天时可见大小不一的橘红色脂肪滴增多(图1)。与第0天相比,培养第12天时C/EBPα、FABP4/ap2和LPL mRNA 水平均升高(P<0.001)(表3)。

图1 分化第0天(A)、6天(B)、12天(C)时油红O的染色

表3 诱导分化第0天与第12 d时C/EBPα、FABP4/ap2、LPL水平比较

2.2 人前体脂肪细胞分化过程中各时间点hsa_circ_0017650表达差异

与分化第0天相比,第1、3、5、7、9、12天hsa_circ_0017650表达均升高,第3天hsa_circ_0017650表达水平最高,随后略有下降(P<0.05)(表4)。

表4 诱导不同时间点时hsa_circ_0017650表达情况

2.3 体质量正常与肥胖人群一般资料比较

与对照组相比,肥胖组BMI、腰臀比、TC、TG和LDL-C水平明显升高(P<0.001)(表5)。

表5 2组年龄、BMI、腰臀比、血脂水平比较

2.4 体质量正常与肥胖人群腹膜后白色脂肪组织中hsa_circ_0017650表达差异

与对照组相比,肥胖组腹膜后白色脂肪组织中hsa_circ_0017650水平显著升高(1.02±0.12vs7.24±0.89)(P<0.001)。

2.5 肥胖患者hsa_circ_0017650表达与BMI、TC、TG、LDL-C及HDL-C表达相关性

Hsa_circ_0017650与BMI、TG和LDL-C呈正相关(r=0.554、0.569、0.618,P<0.001)。

3 讨论

去除白色脂肪可以减少代谢功能障碍[9-10],是治疗肥胖的方向之一。近来研究显示,circRNA在肥胖患者体内异常表达,在脂质形成、脂肪酸代谢中发挥重要作用[6,13]。CircRNA在前体脂肪细胞形成中发挥调控作用,明确circRNA与前体脂肪细胞分化的关系可为肥胖的深入研究提供依据。

通过circRNA微列阵检测内脏脂肪组织与脂肪细胞中circRNA表达谱,发现hsa_circ_0017650差异表达[6],RT-qPCR结果也验证了hsa_circ_0017650在脂肪组织、脂肪细胞中异常表达。CircRNA与lncRNA类似,均可通过招募miRNA调控靶基因的表达而发挥作用[11]。miR-370位于人第14号染色体,在维持肝细胞功能中具有意义,miR-370可调节脂代谢能力[12];miR-370可增强猪脂肪细胞的细胞周期并抑制脂肪累积,可能通过下调过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor γ,PPARγ)发挥此作用[13],PPAR通路在三酰甘油的累积中发挥作用,PPAR可通过调控下游与脂代谢相关基因的表达,促进脂肪细胞的分化,增加脂肪细胞的数量[14]。生物信息网站资料分析显示hsa_circ_0017650与miR-370存在靶向关系。因此初步认定hsa_circ_0017650在脂肪细胞分化中发挥作用。油红O染色结果显示,经诱导的人前体脂肪细胞第6天时可见少量橘红色脂肪滴,第12天可见大量的橘红色脂肪滴,且培养第12天时白色脂肪特异性因子C/EBPα、FABP4/ap2、LPL mRNA水平升高,提示,成功诱导前体脂肪细胞分化,在此分化过程中,hsa_circ_0017650水平总体呈增加趋势,分化第3天到达顶峰,随后略有下降,但仍高于人前体脂肪细胞,提示hsa_circ_0017650可能参与前体脂肪细胞分化,但其参与机制但仍需进一步验证。

至于hsa_circ_0017650是否在患者肥胖中发挥作用仍不得而知,检测结果显示,肥胖患者腹膜后白色脂肪组织中hsa_circ_0017650表达水平显著高于对照组,且与BMI、TC、LDL-C呈正相关,BMI是评估人胖瘦指数的指标;TG是脂肪的重要组成成分,脂肪酸作为TG的直接底物,其代谢异常加速了TG的合成,TG水平升高与肥胖关系密切,中心型肥胖患者血清LDL-C水平显著高于非肥胖者[15]。此结果提示hsa_circ_0017650可能在肥胖中发挥作用,可能通过调控脂代谢、促进脂肪合成而发挥作用,也可能是由肥胖导致的代谢异常引起的。

综上所述,hsa_circ_0017650在人脂肪细胞分化过程以及肥胖者体内高表达,与患者肥胖密切相关。