LncRNA RP11-686D22.10与乳腺癌患者生存期相关并影响乳腺癌细胞系的增殖和侵袭

唐一君，王文龙，李江丽，杨 欢，孙 静

河南科技大学附属安阳市肿瘤医院 1.肿瘤内科五病区；2.外科五病区，河南 安阳 455000；3.苏州大学附属第一医院 甲乳外科，江苏 苏州 215006

乳腺癌是一种起源于乳腺导管上皮细胞的恶性肿瘤,其发病率在女性群体中逐年增长并且呈现年轻化趋势[1]。乳腺癌的治疗手段包括手术治疗、放射治疗和化学药物治疗等,其术后并发症多、易转移、易复发的特点导致乳腺癌患者的预后不理想[2]。乳腺癌的发病机制尚不明确,探究新的生物标志物和治疗靶点有助于乳腺癌的诊断和治疗。

长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)属于非编码RNA家族,参与调节染色体的结构、细胞信号通路转导、表观遗传改变等过程,影响细胞的各种生物学行为和病理发展[3]。研究显示,在垂体腺瘤、视网膜母细胞瘤、胰腺癌等各种肿瘤中都检测到lncRNA的异常表达,其与肿瘤细胞的增殖、侵袭性、代谢等密切相关[4-6]。Ensembl数据库显示,RP11-686D22.10由560个碱基连接而成,其基因定位于17号染色体。RP11-686D22.10与乳腺癌的相关研究报道较少。本研究主要探讨RP11-686D22.10表达水平与乳腺癌患者生存期的相关性,观察RP11-686D22.10是否通过靶向调控miR-454-3p表达影响乳腺癌细胞的增殖及侵袭。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系:人乳腺癌细胞系MCF7、SKBR3、HCC1937、BT549、MB-MDA-468和永生化乳腺上皮细胞系MCF-10A(ATCC公司)。

1.1.2 试剂及试剂盒:miR-NC和miR-454-3p mimics(上海碧云天生物科技有限公司);CCK-8试剂盒、RPMI-1640培养基和Lipofectamine 3000(TaKaRa公司);DMEM培养基和实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)试剂盒(大连宝生物科技有限公司);双荧光报告基因载体野生型WT-RP11-686D22.10和突变型MUT-RP11-686D22.10(Invitrogen公司);荧光素酶报告载体试剂盒和Transwell小室(Promega公司);对照质粒和RP11-686D22.10过表达质粒(上海吉玛制药技术有限公司);一抗:抗-CCND1、-β-catenin、-JUN、-AXIN2、-MMP2、-β-Tubulin抗体(Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 方法

1.2.1 生物信息学分析:通过GEPIA数据库分析RP11-686D22.10表达水平与乳腺癌患者总生存期和无病生存期的关系。通过Linc2Go数据库分析RP11-686D22.10存在结合位点的微小 RNA(microRNA,miRNA)。

1.2.2 实验分组:将MCF7、SKBR3、HCC1937和BT549细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基,MB-MDA-468和MCF-10A细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基,于37 ℃和5%体积分数CO2培养箱中常规培养。将对数增殖期SKBR3细胞接种在24孔板,根据Lipofectamine 3000转染试剂说明书分别将对照质粒和RP11-686D22.10过表达质粒转染至SKBR3细胞,记为NC组和RP11-686D22.10组。

1.2.3 RT-qPCR检测RP11-686D22.10和miR-454-3p的表达水平:用Trizol试剂提取MCF7、SKBR3、HCC1937、BT549、MB-MDA-468、MCF-10A及质粒转染后2组SKBR3细胞的总RNA,通过紫外分光光度计定量RNA的浓度,反转录合成cDNA。RT-qPCR反应条件:97 ℃ 50 s, 59 ℃ 32 s, 73 ℃ 32s, 循环31次。RP11-686D22.10相对表达量以GAPDH为内参,miR-454-3p相对表达量以U6为内参。引物序列如下,GAPDH上游引物:5′-AATCCCATCACCA TCTTC-3′,下游引物:5′-AGGCTGTTGTCATACTTC-3′;RP11-686D22.10上游引物:5′-CTGGAACTTAC AGGCGCATT-3′,下游引物:5′-CCTCCCATGGTCACA TTTCT-3′;miR-454-3p上游引物:5′-GCGCGTAGTG CAATATTGCTTA-3′,下游引物:5′-AGTGCAGGGTCC GAGGTATT-3′;U6上游引物:5′-CGCTTCGGCAGC ACATATACTAA-3′,下游引物:5′-TATGGAACGCTT CACGAATTTGC-3′。通过2-△△Ct公式计算RP11-686D22.10和miR-454-3p相对表达量。

1.2.4 CCK-8法检测细胞增殖:用胰蛋白酶消化2组SKBR3细胞,分别以6×103个/孔接种在96孔板。分别在接种后第1、2、3、4、5 d,每孔加25 μL的CCK-8试剂,充分混匀,在37 ℃和5%体积分数CO2培养箱中孵育2.5 h,通过酶标仪检测各孔在波长450 nm处的吸光度(A)值。

1.2.5 Transwell小室法检测细胞侵袭:用RPMI-1640培养基稀释基质胶,以每孔30 μL加入Transwell小室上室,培养箱内固定6 h。取2组SKBR3细胞以每孔200μL(2×104个/孔)加入Transwell小室上室,在小室上室加入650 μL含15%血清的培养基,连续培养24 h。通过2%多聚甲醛固定35 min,0.4%结晶紫溶液染色35 min,洗去多余染液并风干,倒置显微镜下观察侵袭细胞数。

1.2.6 双荧光素酶报告基因载体实验检测RP11-686D22.10与miR-454-3p的靶向关系:用脂质体转染法分别将miR-454-3p/WT-RP11-686D22.10、miR-NC/WT-RP11-686D22.10、miR-454-3p/MUT-RP11-686D22.10、miR-NC/MUT-RP11-686D22.10共转染至对数增殖期的SKBR3细胞,培养箱常规培养46 h,分别检测萤火虫荧光素酶活性值和海肾荧光素酶活性值,计算各组SKBR3细胞相对荧光素酶活性。

1.2.7 Western blot检测Wnt/β-catenin信号通路蛋白质:在各组SKBR3细胞中加入600 μL细胞裂解液,定量蛋白质浓度后,经SDS-PAGE分离和聚丙烯酰胺凝胶转膜,7%脱脂牛奶封闭3 h,加入一抗稀释液:抗-CCND1(1∶2 000)、-β-catenin(1∶1 000)、-JUN(1∶2 000)、-β-Tubulin(1∶2 000)、-AXIN2(1∶500)和抗-MMP2(1∶500)抗体,低温孵育24 h。加入羊抗鼠二抗稀释液(1∶5 000),室温孵育1 h,加入化学发光液,在凝胶成像系统中观察聚丙烯酰胺膜上蛋白质条带。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 RP11-686D22.10与乳腺癌患者生存期的关系

与RP11-686D22.10低表达的乳腺癌患者相比,RP11-686D22.10高表达的乳腺癌患者总生存期较长(P<0.01),并且无病生存期较长(P<0.01)(图1)。

图1 RP11-686D22.10与乳腺癌患者生存期的关系

2.2 乳腺癌细胞系中RP11-686D22.10的表达

与MCF-10A比较,MCF7、SKBR3、HCC1937、BT549和MB-MDA-468中RP11-686D22.10的表达量下降(均P<0.05),其中SKBR3细胞RP11-686D22.10表达水平最低(P<0.01),因而选用SKBR3细胞进行后续实验(图2)。

*P<0.05,**P<0.01 compared with MCF-10A.

2.3 质粒转染后SKBR3细胞中RP11-686D22.10的表达

RP11-686D22.10组RP11-686D22.10表达量为10.13±2.28,显著高于NC组的1.06±0.52(P<0.01)。

2.4 RP11-686D22.10对SKBR3细胞增殖的影响

与NC组比较,RP11-686D22.10组SKBR3细胞从第2天开始起增殖活力下降(P<0.05)(图3)。

*P<0.05,**P<0.01 compared with NC.

2.5 RP11-686D22.10对SKBR3细胞侵袭的影响

RP11-686D22.10组SKBR3细胞侵袭数为(54±9)个,显著低于NC组的(95±13)个(P<0.01)(图4)。

图4 RP11-686D22.10对SKBR3细胞侵袭的影响

2.6 RP11-686D22.10和miR-454-3p靶向关系

Linc2Go数据库预测显示(图5),RP11-686D22.10与miR-454-3p存在互补结合位点。双荧光素酶报告基因载体实验显示(图6),与miR-NC相比,过表达miR-454-3p可抑制野生型载体WT-RP11-686D22.10的相对荧光素酶活性(P<0.01),不能抑制突变型载体MUT-RP11-686D22.10的相对荧光素酶活性。

图5 RP11-686D22.10与miR-454-3p的互补序列

*P<0.01 compared with miR-NC.

2.7 RP11-686D22.10对miR-454-3p表达的影响

RP11-686D22.10组miR-454-3p表达量为1.03±0.54,显著低于NC组的5.94±1.29(P<0.01)。

2.8 RP11-686D22.10对Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达的影响

与NC组比较,RP11-686D22.10组Wnt/β-catenin信号通路蛋白CCND1、β-catenin、JUN、AXIN2和MMP2表达水平降低(图7)。

*P<0.01 compared with NC.

3 讨论

越来越多的研究显示,lncRNA表达异常与乳腺癌的发生、发展显著相关,其可能成为乳腺癌的诊断标志物和治疗靶点[7]。LncRNA NEAT1 在乳腺肿瘤和细胞系中显著上调,沉默lncRNA NEAT1可以有效促使乳腺癌细胞对紫杉醇敏感;miR-23a-3p是lncRNA NEAT1的直接靶标[8]。LncRNA HOTTIP在乳腺癌干细胞中表达上调,其表达水平与乳腺癌进展呈正相关,过表达lncRNA HOTTIP促进细胞集落形成、增加干细胞标志物表达并降低乳腺癌细胞分化标志物的表达;敲除lncRNA HOTTIP能够抑制乳腺癌干细胞的干细胞样特性[9]。致癌性lncRNA HOTAIR表达水平与乳腺癌的恶性程度呈正相关,且与乳腺癌细胞的放射敏感性呈负相关[10]。RP11-686D22.10在乳腺癌中的表达和功能并不清楚。本研究通过GEPIA数据库分析显示,RP11-686D22.10高表达的乳腺癌患者总生存期和无病生存期明显长于RP11-686D22.10低表达的乳腺癌患者,提示RP11-686D22.10高表达患者预后较好。本研究结果显示,乳腺癌细胞系中RP11-686D22.10表达明显低于永生化乳腺上皮细胞,表明RP11-686D22.10可能在乳腺癌细胞中发挥抑癌功能。同时,过表达RP11-686D22.10显著抑制乳腺癌细胞的增殖及侵袭能力,提示RP11-686D22.10可能抑制乳腺癌的发生发展。

目前已有多项研究证实,lncRNA可以作为竞争性RNA与微小RNA(miRNA)互补结合,调节各种信号通路蛋白的表达[11]。LncRNA和miRNA的相互作用在乳腺癌的发生、发展过程中起到不可替代的作用[12]。本研究用Linc2Go生物数据库分析显示,RP11-686D22.10与miR-454-3p具有互补结合位点。双荧光素酶报告载体实验进一步证实RP11-686D22.10可靶向结合miR-454-3p。研究表明,miR-454-3p在奥沙利铂(oxaliplatin)耐药的结直肠癌细胞中表达上调,抑制miR-454-3p表达会使耐药细胞对奥沙利铂重新敏感,并增强奥沙利铂诱导的细胞凋亡[13]。miR-454-3p在胶质瘤、肝癌和宫颈癌等肿瘤组织中表达上调,可诱导细胞的增殖并减少细胞凋亡[14]。以上表明,miR-454-3p主要发挥癌基因作用。有研究[21]显示,miR-454-3p在转移性乳腺癌组织中过表达,其与乳腺癌患者的总生存期和无病生存期负相关,能够显著促进乳腺癌细胞的增殖和转移。本研究进一步证实,RP11-686D22.10能够负调控miR-454-3p的表达。有研究报道miR-454-3p通过促进Wnt/β-catenin信号通路转导,加速乳腺癌的增殖和转移[21]。本研究结果显示,过表达RP11-686D22.10后,SKBR3细胞Wnt/β-catenin信号通路蛋白CCND1、β-catenin、JUN、AXIN2和MMP2表达水平降低。提示,过表达RP11-686D22.10可抑制Wnt/β-catenin信号通路转导,RP11-686D22.10是通过靶向miR-454-3p调控乳腺癌细胞的生物学行为。

综上所述,RP11-686D22.10表达水平与乳腺癌患者生存期密切相关,乳腺癌细胞系中RP11-686D22.10表达下调;过表达RP11-686D22.10通过降低miR-454-3p表达抑制乳腺癌SKBR3细胞的增殖、侵袭。RP11-686D22.10可能成为乳腺癌潜在的分子标志物和治疗靶点。