山萘酚调控VPS9D1-AS1/miR-377-3p对人宫颈癌细胞系SiHa增殖和凋亡的影响

张禹鑫，朱紫薇，张 燕，胡玉红

佳木斯大学附属第一医院 妇产科，黑龙江 佳木斯 154000

宫颈癌起源于子宫颈的上皮赘生性转化,是全世界妇女与癌相关死亡的第四大原因[1-2]。寻找更有效的抑制宫颈癌细胞增殖和转移的新药将有助于宫颈癌的治疗。作为一种从蔬菜和水果中分离出来的天然类黄酮化合物,山萘酚(kaempferol)具有丰富的药理特性,例如抗菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗糖尿病和心脏保护活性[3-4],因此,引起了越来越多的关注。迄今为止已经在多种恶性肿瘤中进行了山萘酚的研究。例如,山萘酚可以抑制卵巢癌[5]、乳腺癌[6]和非小细胞肺癌[7]的细胞增殖。但山萘酚在宫颈癌中的系统性作用尚不清楚。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)和微小RNA(microRNA,miRNA)是调控生物过程和病理进展的重要因子,近年来备受关注。根据竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)理论,lncRNA竞争性结合并螯合某些miRNA,随后释放miRNA靶基因并增加转录和翻译产物的水平[8]。LncRNA VPS9D1反义RNA 1(VPS9D1 antisense RNA 1,VPS9D1-AS1)可作为miR-525-5p的分子海绵,促进结直肠癌细胞的致癌性[9]。VPS9D1-AS1敲低可抑制急性髓细胞性白血病细胞增殖,阻滞细胞周期以及抑制皮下肿瘤的形成。此外,VPS9D1-AS1敲低增强了新型组蛋白脱乙酰基酶抑制剂chidamide对急性髓细胞性白血病细胞增殖的抑制作用[10]。miR-377-3p在宫颈癌中低表达[11],其下调可预测宫颈癌患者的不良预后,miR-377-3p过表达抑制宫颈癌中的细胞侵袭迁移和上皮间质转化[12]。此外,山萘酚通过下调miRNA抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭[13]。但是,尚无有关山萘酚对宫颈癌细胞中VPS9D1-AS1/miR-377-3p表达的影响的报告。因此,本研究拟探讨山萘酚对宫颈癌细胞增殖、迁移侵袭和凋亡以及VPS9D1-AS1/miR-377-3p表达的影响,以阐明其可能的分子途径,进而,有助于进一步了解山萘酚对宫颈癌的抗癌作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞:人宫颈癌细胞系SiHa(武汉普诺赛生命科技有限公司),在37 ℃、5% CO2的条件下,于补充10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养。

1.1.2 试剂:Lipofectamine 2000(Invitrogen公司);si-NC、si-VPS9D1-AS1、pcDNA-VPS9D1-AS1、miR-377-3p抑制剂(anti-miR-377-3p)、miR-377-3p模拟物和miR-NC(GenePharma公司);Annexin V-FITC/碘化丙锭(propidium iodide,PI)试剂盒(武汉艾美捷科技有限公司),BCA蛋白质测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司),抗Bcl-2和抗Bax抗体(Abcam Biotechnology公司),质粒pmirGLO(Promega Corporation公司);PrimeScript RT试剂盒和SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa公司)以及All-in-OneTMmiRNA RT-qPCR检测试剂盒(GeneCopoeia公司)。山萘酚(kaempferol,25 mg,含量≥97.0%;Sigma-Aldrich公司),溶解并于二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)中储存。然后,将山萘酚溶液通过0.22 μm的过滤器灭菌,并在-4 ℃下保存。用时用RPMI-1640将山奈酚溶液稀释至实验浓度5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分组:将细胞分为对照组、山萘酚低、中、高剂量组(5、10和20 μmol/L山萘酚作用24 h组[7])、si-NC组(转染si-NC)、si-VPS9D1-AS1组(转染si-VPS9D1-AS1)、山萘酚+pcDNA-VPS9D1-AS1组(20 mg/L山萘酚+转染pcDNA-VPS9D1-AS1)、山萘酚+anti-miR-377-3p组(20 mg/L山萘酚+转染anti-miR-377-3p)。转染前24 h,将细胞接种到6孔板中,当细胞达到50%汇合时,根据Lipofectamine 2000的说明手册进行转染。孵育6～8 h后,用含20 mg/L山萘酚或不含山萘酚的完全培养基更新培养基。进一步孵育24～48 h后,收获细胞。用实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR)评估转染效率。

1.2.2 RT-qPCR检测mRNA:用试剂Trizol分离细胞(1×105)总RNA,并在NanoDrop 2000分光光度计上定量。用PrimeScript RT试剂盒和SYBR Premix Ex TaqTM测量VPS9D1-AS1表达水平,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作为对照。用All-in-OneTMmiRNA RT-qPCR检测试剂盒确定miR-377-3p表达,以U6作为对照。在Thermal Cycler CFX6系统上进行RT-qPCR,用2-△△Ct方法进行计算。引物序列如下:VPS9D1-AS1(F:5′-AGTGGCCGTTTTACA GAGACA-3′,R:5′-CATGCCAAGCTACGGGAAGG-3′)。miR-377-3p(F:5′-GGGAGGCAGTGTATTGTT A-3′,R:5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′);GAPDH(F:5′-TGTTCGTCATGGGTGTGAGA-3′,R:5′-ATGG CATGGACTGTGGTCAT-3′)和U6(F:5′-ATTGGAA CGATACAGAGAAGATT-3′,R:5′-GGAACGCTTCAC ACATTA TT-3′)。

1.2.3 MTT法测定细胞增殖:将转染细胞制成单细胞悬液,然后将细胞(每个孔1×104个细胞)铺在96孔板中,在37 ℃和5% CO2下培养24～72 h。加5% MTT溶液(20 μL/孔)孵育4 h。之后,在黑暗中加DMSO(100 μL/孔),以溶解结晶。随后,用酶标仪,在490 nm的波长下测试吸光度(A)。以时间为X轴,吸光度(A)为Y轴,绘制细胞的增殖曲线。

1.2.4 集落形成实验:处理细胞后,分别接种在6孔板(500个细胞/孔)中,孵育2周。当用肉眼观察到克隆斑点时,终止培养。甲醇固定细胞,并用结晶紫染色。在光学显微镜下观察超过50个细胞形成的集落数。

1.2.5 流式细胞测量术检测细胞凋亡:用结合缓冲液将SiHa细胞制成单细胞悬液。随后,将细胞与annexin V-FITC一起孵育,然后在黑暗条件下与PI进一步孵育5 min。采用流式细胞仪测量细胞凋亡率(%)。

1.2.6 Western blot检测蛋白质:细胞经过相关处理或转染后,以400 μL RIPA裂解缓冲液在冰上裂解细胞30 min,分离总蛋白质。使用BCA蛋白质测定试剂盒测定蛋白质的浓度。Western blot用Bio-Rad Bis-Tris凝胶系统。蛋白质经酰胺凝胶电泳分离,然后转移到硝酸纤维素膜膜上,与抗Bax和抗Bcl-2抗体(1∶1 000)一起孵育后,再与山羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶(HRP)在室温下孵育1 h,然后转移至Bio-Rad ChemiDocTMXRS系统,在膜表面上补充化学发光底物,以GAPDH为对照,使用Image Lab软件对条带的强度进行定量。

1.2.7 划痕试验测定细胞迁移:将细胞接种在6孔板中,与10%胎牛血清一起孵育过夜。当细胞汇合达到90%～100%时,用微量移液器吸头在板底部进行垂直线性刮擦。之后,将细胞再次与无血清培养基一起孵育。在刮擦后第0 h和24 h在倒置显微镜下观察迁移距离并拍照,ImageJ软件分析迁移距离(μm)。

1.2.8 Transwell小室法测定细胞侵袭:Transwell顶室涂有用RPMI-1640稀释至50 μg/mL的Matrigel,以覆盖聚碳酸酯膜。通过无血清培养基将不同处理的细胞(1×104个细胞/mL)制备成单细胞悬液,并接种到顶室中。继而,将含有20%胎牛血清的RPMI-1640(600 μL)添加到Transwell底室。孵育48 h后,使用棉签小心地擦除顶室中未穿透膜的细胞,立即用甲醇固定-结晶紫染色,并在显微镜下,对3个随机选择的区域中底室穿透膜的细胞进行计数。

1.2.9 荧光素酶活性检测VPS9D1-AS1和miR-377-3p的结合位点:将含miR-377-3p结合位点的野生型(wt)和突变型(mut)-VPS9D1-AS1片段插入pmirGLO质粒中,以合成报告基因质粒wt-VPS9D1-AS1和mut-VPS9D1-AS1。将细胞接种到6孔板中,用lipofectamine 2000转染wt-VPS9D1-AS1、mut-VPS9D1-AS1和miR-NC、miR-377-3p模拟物。48 h后在Dual-Luciferase Reporter Assay系统中确定荧光素酶相对活性。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 山萘酚对SiHa增殖、凋亡及Bax/Bcl-2蛋白表达的影响

与对照组相比,山萘酚低剂量、中剂量和高剂量组SiHa细胞中VPS9D1-AS1表达水平逐渐降低,miR-377-3p表达水平逐渐升高;集落形成数依次减少,凋亡率和Bax蛋白表达水平逐渐升高,Bcl-2蛋白表达水平以及48 h和72 h的细胞活性逐渐降低;变化均呈浓度依赖性(P<0.05)(表1,图1)。

表1 山萘酚抑制SiHa集落形成诱导凋亡

*P<0.05 compared with the control group; #P<0.05 compared with the 5 μmol/L of kaempferol; △P<0.05 compared with the 10 μmol/L of kaempferol.

2.2 山萘酚对SiHa迁移和侵袭的影响

与对照组相比,山萘酚低剂量、中剂量和高剂量组SiHa细胞的迁移距离和侵袭细胞数依次降低,均呈浓度依赖性(P<0.05)(图2,表2)。

表2 山萘酚抑制SiHa迁移侵袭

图2 山萘酚对SiHa细胞迁移(A)和侵袭(B)的影响

2.3 沉默VPS9D1-AS1对SiHa增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响

Si-VPS9D1-AS1组VPS9D1-AS1表达水平低于si-NC组,miR-377-3p表达水平高于si-NC组,集落形成数少于si-NC组,凋亡率和Bax蛋白表达水平高于si-NC组,Bcl-2蛋白表达水平、48和72 h细胞活性、迁移距离和侵袭细胞数均低于si-NC组(P<0.05)(图3,表3)。

表3 沉默VPS9D1-AS1诱导SiHa细胞凋亡而抑制细胞集落形成、迁移和侵袭

*P<0.05 compared with si-NC.

2.4 VPS9D1-AS1靶向miR-377-3p

软件starbase预测的VPS9D1-AS1和miR-377-3p的互补序列如图4A所示。miR-377-3p与wt-VPS9D1-AS1共转染的荧光素酶活性比miR-NC与wt-VPS9D1-AS1共转染低,差异有统计学意义(P<0.05)(图4B)。

A.complementary sequences of VPS9D1-AS1and miR-377-3p predicted by soft ware star base; B.detection of luciferase activity; *P<0.05 compared with miR-NC.

2.5 过表达VPS9D1-AS1或抑制miR-377-3p对山萘酚处理的SiHa细胞增殖和凋亡的影响

与山萘酚组相比,山萘酚+pcDNA-VPS9D1-AS1组SiHa细胞的VPS9D1-AS1表达水平升高,山萘酚+pcDNA-VPS9D1-AS1组或山萘酚+anti-miR-377-3p组miR-377-3p表达水平降低,集落形成数增加,凋亡率、Bax蛋白表达水平减少,Bcl-2蛋白表达水平、48 h的细胞活性和72 h的细胞活性增加(P<0.05)(图5,表4)。

表4 过表达VPS9D1-AS1或抑制miR-377-3p逆转山萘酚对SiHa增殖和凋亡的影响

*P<0.05 compared with the control; #P<0.05 compared with kaempferol.

2.6 过表达VPS9D1-AS1或抑制miR-377-3p对山萘酚处理的SiHa细胞迁移和侵袭的影响

山萘酚组与对照组相比的结果同2.2。与山萘酚组相比,山萘酚+pcDNA-VPS9D1-AS1组或山萘酚+anti-miR-377-3p组SiHa细胞迁移距离和侵袭细胞数增加(P<0.05)(图6,表5)。

表5 过表达VPS9D1-AS1或抑制miR-377-3p逆转山萘酚对SiHa细胞迁移和侵袭的作用

图6 过表达VPS9D1-AS1或抑制miR-377-3p逆转山萘酚对SiHa细胞迁移(A)和侵袭(B)的影响

3 讨论

抑制肿瘤细胞的增殖和转移以及诱导肿瘤细胞的凋亡是最有效的癌治疗方法[13],山萘酚对不同类型的癌均具有治疗作用,并且人们正在考虑将其作为可能的治疗癌方法。本研究结果显示,在山萘酚治疗癌细胞中发挥促凋亡作用的Bax表达增加,发挥抗凋亡作用的Bcl-2表达减少,5、10和20 μmol/L山萘酚以浓度依赖方式抑制宫颈癌SiHa细胞的活性,集落形成,迁移和侵袭。同时,山萘酚以浓度依赖方式促进SiHa细胞的凋亡。进一步证实,山萘酚对宫颈癌的有效抗肿瘤作用,与先前的研究[7]一致。

VPS9D1-AS1是许多癌的重要调控因子,该因子的缺失可抑制癌细胞增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡,而VPS9D1-AS1过表达导致相反的结果,但VPS9D1-AS1对于宫颈癌的作用机制还需进一步研究。本研究显示,沉默VPS9D1-AS1可促进SiHa细胞凋亡,抑制细胞活性、集落形成、迁移和侵袭,在宫颈癌中同样具有促癌作用,可望成为宫颈癌诊断和治疗的新靶标。由于miRNA在控制转移和细胞凋亡中的作用,miRNA既可作为抑癌剂又可作为癌基因来调节宫颈癌进程。为了进一步揭示VPS9D1-AS1的促癌机制,本研究使用starbase鉴别可能与VPS9D1-AS1相互作用的miRNA miR-377-3p。荧光素酶报告基因实验显示,miR-377-3p可以直接与宫颈癌细胞中的VPS9D1-AS1结合。此外,在宫颈癌SiHa细胞中,沉默VPS9D1-AS1可负调控miR-377-3p水平。一些药物可以通过调节癌细胞中的lncRNA的表达来抑制癌细胞的生物行为[13]。先前的研究表明,山萘酚通过上调人肺癌细胞中的miR-340抑制增殖但增加凋亡和自噬[14]。但山萘酚是否通过VPS9D1-AS1/miR-377-3p影响宫颈癌的细胞行为尚未明确。本研究发现,5、10或20 μmol/L山萘酚可下调SiHa细胞中VPS9D1-AS1的表达,上调miR-377-3p的表达,并呈现浓度依赖性。此外,过表达VPS9D1-AS1或抑制miR-377-3p明显逆转了山萘酚对SiHa细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。综合这些结果表明,VPS9D1-AS1和miR-377-3p参与了山萘酚对宫颈癌细胞的作用,并提示山萘酚通过下调VPS9D1-AS1靶向miR-377-3p而对宫颈癌发挥抗肿瘤作用。

综上所述,山萘酚可通过调控VPS9D1-AS1/miR-377-3p诱导宫颈癌细胞凋亡,并抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭。本研究有助于了解山萘酚对宫颈癌的抗癌作用,为深入探索山萘酚对宫颈癌的治疗提供理论依据。