种龄及接种量协同作用对纤维素酶活性的影响

贾洪柏　许超　刘军　何凡　丁宏云

摘要［目的］分析菌种种龄和接种量的协同作用对纤维素酶活性的影响，为生产纤维素酶奠定理论基础。［方法］分别对单菌种（DQ1）和混合菌种（DQ1+DQ2）不同种龄和接种量进行发酵培养试验，测定各处理的纤维素酶活力，分析不同处理纤维素的变化趋势及差异。［结果］在培养过程中，不同种龄的纤维素酶活力都在第8天达到最大；单菌种接种量为1%和2%时种龄4的纤维素酶活力最高，分别达到19.57和20.50 IU/mL；混合菌种接种量为1%和2%时种龄1的纤维素酶活力最高，分别为21.21和20.82 IU/mL。在第8天时，相同菌种和接种量的不同种龄的纤维素酶活力有一定差异。［结论］采用该研究的单菌或混合菌生产纤维素酶时，最优接种条件是种龄4、接种量2%，可以获得较高的纤维素酶活力，并且生产成本较低。

关键词 种龄；接种量；协同作用；纤维素酶；活性

中图分类号 X172 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2023）06-0001-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.06.001

Synergistic Effects of Seeding Age and Inoculum Size on Cellulase Activity

JIA Hong－bai1，2，XU Chao1，LIU Jun1 et al

（1.Anji Guoqian Environmental Technology Co.， Ltd.， Huzhou， Zhejiang 313300;2.College of Life， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040）

Abstract ［Objective］To analyze the effect of the synergistic effect of strain seeding age and inoculation size on cellulase activity and lay a theoretical foundation for cellulase production.［Method］The fermentation experiments of single strain （DQ1） and mixed strain （DQ1 + DQ2） with different seeding ages and inoculum sizes were carried out， and the change trend and difference of cellulase activities were analyzed.［Result］ During the culture process， the cellulase activity of different ages reached its maximum on the 8th day.The cellulase activity of seeding age 4th reached the highest at 1% and 2% inoculation of single strain， they were 19.57 and 20.50 IU/mL， respectively. And the cellulase activity of seeding age 1st reached the highest at 1% and 2% inoculation of single strain， they were 21.21 and 20.82 IU/mL. At the 8th day， the cellulase activity of different seeding ages of the same strain and inoculation size had certain differences.［Conclusion］ When using the single or mixed strain in this study to produce cellulase， the optimal inoculation conditions are seeding age 4th， inoculation size 2%， which can obtain higher cellulase activity and lower production cost.

Key words Seeding age;Inoculum size;Synergistic effect;Cellulase;Activity

我國作为农业大国，每年都会产生几亿吨的秸秆，如果不能良好地利用秸秆资源，则会造成环境污染，影响人类健康［1-2］。利用秸秆等纤维素原料生产燃料乙醇是目前研究的热点［3］，其中利用纤维素酶将纤维素转化为小分子有机物，是目前利用纤维素类物质的有效措施［4-7］。燃料乙醇生产中存在的最大问题是如何降低生产成本，其中如何提高纤维素酶的产量是降低生产成本的一个重要因素。近年来，学者们从多方面对产纤维素酶的微生物进行了研究，包括产纤维素酶菌种的筛选［8-11］、微生物菌种的诱变，如常温常压等离子诱变［12］、紫外线诱变［13］、亚硝基胍诱变［14］等，以及利用分子手段提高微生物产纤维素酶［15-16］等，并且取得了较好的结果。

发酵工艺的发展最终都是为了提高发酵过程产物的产量。种子发酵阶段的优化被认为是最后发酵阶段优化提高培养物产量的补充。有大量的文献已经报道了发酵最后阶段优化提高最终发酵产物的例子［17-19］。笔者针对液体种子种龄和接种量对纤维素酶（CMC）活性的影响进行了研究，旨在为此方面的研究和生产奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种。

利用富集培养的方法从大庆野外分离得到的2株产纤维素酶镰刀菌属DQ1和DQ2。

1.1.2 柳枝草。

采自东北林业大学大庆生物技术研究院的柳枝草种植基地。

1.1.3 药品。

购自天津市大茂化学试剂厂的分析纯试剂。

1.1.4 纤维素分解菌初筛分离平板培养基。

KH2PO4 2.0 g，（NH4）2SO4 1.4 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，CaCl2 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.05 g，MnSO4 1.6 mg，ZnCl2 1.7 mg，CoCl2 0.2 mg，蒸馏水1 000 mL，pH为5.5～6.0，以滤纸为唯一碳源。

1.1.5 羧甲基纤维素钠复筛选培养基。

CMC-Na 20 g，NaHPO4 2.5 g，KH2PO4 1.5 g，蛋白胨2.5 g，酵母膏0.5 g，蒸馏水1 000 mL，琼脂20 g，pH为7.0～7.2。

1.1.6 牛肉膏蛋白胨分离培养基。

牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL，pH为7.0～7.2。

1.1.7 柳枝草液体培养基。

KH2PO4 2.0 g，（NH4）2SO4 1.4 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，CaCl2 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.05 g，MnSO4 1.6 mg，ZnCl2 1.7 mg，CoCl2 0.2 mg，蛋白胨 0.5 g，尿素0.3 g，碱处理后的柳枝草粉10 g，蒸馏水1 000 mL，pH为5.5～6.0。

柳枝草粉的制备：将柳枝草剪成2～3 cm的小段，用2%的NaOH溶液浸泡24 h；用流水冲洗后，将pH调至中性，烘干；将烘干的小段粉碎至60目备用。

1.1.8 种子液体培养基。

同柳枝草液体培养基，将柳枝草粉改为羧甲基纤维素钠。

1.2 试验方法

1.2.1 培养方法。

向装有150 mL种子液体培养基的2个三角瓶中一个接种菌株DQ1两环，另一个接种菌株DQ1与DQ2各1环，在150 r/min、28 ℃条件下振荡培养。分别于接种后的第1天、第2天、第3天、第4天、第5天取种子液按照体积比1%和2%的接种量分别接种到装有200 mL柳枝草液体培养基中同条件下振荡培养，同时测定种子液菌种浓度。加入菌种后第2天测定CMC活力，连续测定10 d，每个样品重复3次。

1.2.2 酶活力测定方法。

取一定的培养液于4 ℃、4 000 r/min离心15 min，取上清液作为粗酶液测定酶活力。

CMC活力测定［20］：取经适当稀释的酶液1 mL，加入1 mL含1％ CMC的pH 4.8的醋酸-醋酸钠缓冲液，混匀，50 ℃ 恒温水浴30 min，加入2.5 mL DNS试剂，沸水中煮沸5 min，后用流水冷却至室温，定容至25 mL，在520 nm下比色，测出OD值，查阅标准曲线后，求出溶液中的葡萄糖含量。以国际单位为依据，定义每分钟催化纤维素水解生成1 μmol 葡萄糖的酶量为一个酶活力单位IU。

DNS试剂配制：称取200 g酒石酸钾钠，溶于一定量水中，加热溶解，添加10.0 g 3，5-硝基水杨酸、10.0 g氢氧化钠，溶解后加入2.0 g苯酚、0.5 g无水亚硫酸钠，全部加热溶解后，冷却至室温，定容至1 000 mL。用前7 d配制。

1.3 数据统计分析

利用SPSS 17.0软件对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 种子浓度的变化

从各种龄种子浓度（图1）可以看出，无论是单菌种（DQ1）还是混合菌种（DQ1+DQ2）在培养过程中菌种浓度都是先升高后降低，在种龄3时达到最高，单菌种的浓度达到2.1×105 CFU/mL，混合菌种的浓度达到了4.9×106 CFU/mL。

2.2 CMC活力的变化趋势

从不同菌种不同接种量的各种龄CMC活力变化趋势（图2）可以看出，在整个的试验过程中，种龄1和种龄2在第4天时的CMC活力有一个小幅升高，而后降低再升高，在第8天时达到最高，然后再降低；种龄4和种龄5的CMC活力的变化趋势都是先升高，在第8天时达到最高，而后再降低。接种单菌种种龄3的CMC活力变化趋势与种龄1和种龄2相同，但是小幅增高的时间向后推迟到了第5天；接种混合菌种种龄3的CMC活力与种龄2的CMC活力在同一时间的变化趋势相同，即逐渐降低，再逐渐升高，在第8天时达到最高，而后逐渐降低。

韩美玲等［21］研究发现糙皮侧耳在不同碳源条件下都表现出羧甲基纤维素酶活性升高—降低—升高的过程，这与该研究中种龄1和种龄2的CMC活力变化趋势相同。CMC活力出现小高峰可能是菌体数量较少，并且适应性弱，在接种后种子液中易利用的营养成分促进了菌种的快速生长，从而使CMC活力升高；当这部分碳源消耗尽后，随着CMC对培养液中纤维素的作用，CMC活力降低。但随着微生物数量的增加，CMC活力又开始升高。

2.3 不同种龄及接种量对CMC活力的影响

从试验中第8天各处理的CMC活力（表1）可以看出，以单菌种接种培养的CMC活力2种接种量（1%、2%）种龄4的CMC活力都最高，分别达19.57和20.50 IU/mL。以混合菌种接种培养的CMC活力，接种量为1%时种龄1的CMC活力最高，达21.21 IU/mL；接种量为2%时种龄1的CMC活力最高，达20.82 IU/mL。经方差分析和多重比较表明，试验第8天時，接种相同菌种和接种量的不同种龄处理的CMC活力有一定差异。从图1～2可以看出，种龄3的种子浓度最高，但在接种培养过程中的CMC活力普遍较低，这与孙宝婷等［22］的研究结果相反。这可能是种子培养阶段与扩大培养阶段的培养基碳源不同导致的。接种带来的种子液中易利用的营养成分较少，接入新的培养液后，菌种生长缓慢，大量接种的微生物死亡或停滞［23］，导致酶活力较低。师璐等［24］研究发现，羧甲基纤维素钠是作为产纤维素酶最好的碳源。而种龄1和种龄2虽然菌种生长力较弱，但接种带来的种子液中易利用的营养成分相对较多，有利于微生物快速生长繁殖；虽然种龄4的种子液中易利用的营养成分也很少，但种子生长力强，适应性强，能很快地在新的培养液中生长繁殖，因此培养液中的CMC活力都比种龄3的CMC活力高。因为种龄5的种子种龄较大，生长力较弱，加上易利用的营养成分少，所以CMC活力也较低。

从表1还可以看出，无论是单菌种还是混合菌种，种龄1和种龄2接种量2%的CMC活力均低于接种量1%的CMC活力；种龄3、种龄4和种龄5接种量2%的CMC活力均高于接种量1%的CMC活力。这说明接种量对CMC活力的影响还受到种龄的影响，在确定最佳接种条件时，只利用单因素试验得到的结果是不准确的。产生这种结果的原因是当种龄小、接种量大时，初期菌种密度大，初级代谢产物多，菌体易衰老；而接种量较少则不利于菌体快速增殖和产酶［24］。接种量较小会延长菌种在发酵罐中生长速度，降低生产效率；而接种量较大会降低培养基中溶解氧的含量，影响好氧菌的生长和产物的合成［25］。进一步对相同菌种第8天的CMC活力方差分析和多重比较表明，在接种单菌种时，种龄3和种龄5不同接种量的CMC活力差异显著，其他种龄的CMC活力差异不显著；在接种混合菌种时，种龄3、种龄4和种龄5不同接种量的CMC活力差异显著，其他2个种龄的CMC活力差异不显著。余梦頔等［26］研究发现，接种量对纳豆枯草杆菌产纳豆激酶无显著影响。因此，接种量与种龄共同对发酵产物的产量产生影响。

3 结论

在第8天时，相同菌种和接种量的不同种龄的纤维素酶活力有一定差异。种龄和接种量对微生物产纤维素酶具有协同作用；种龄不同，不同的接种量对纤维素酶活性影响不同。采用该研究的菌种制备纤维素酶时，无论单菌种还是混合菌种，最优接种条件都是种龄4、接种量2%，可以缩短发酵期的培养时间，达到节能降耗的效果。

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基金项目 中央高校基本科研业务费专项资金项目（2572014BA16）。

作者简介 贾洪柏（1978—），男，辽宁辽阳人，实验师，博士，从事环境微生物学和微生物遗传学研究。

收稿日期 2022-05-03