接种褐环乳牛肝菌对樟子松及油松根际土壤细菌群落的影响

包润泽　张星　姚庆智*

摘要：［目的］探究褐環乳牛肝菌（Suillus luteus）对樟子松（Pinus sylvestris var.mongolica）和油松（P.tabulaeformis）根际土壤细菌群落结构的影响。［方法］利用Illumina MiSeq高通量测序技术，分析2种松树的根际土壤在接种S.luteus与未接种处理下的细菌群落结构，同时结合土壤有机碳（C）、含水量（WC）、速效磷（P）和速效氮（N）进行相关研究。［结果］接种S.luteus后2种松树根际土壤中的有机碳、含水量、速效磷和速效氮含量均大于对照组。综合细菌Alpha多样性指数及OTU-Venn发现，接种S.luteus后的樟子松和油松根际土壤细菌相对丰度与对照组存在显著差异（P<0.05）。统计学分析显示，接种S.luteus显著影响了根际土壤细菌的丰富度，且有机质和物种数量、Shannon指数、ACE指数呈显著正相关；此外，土壤含水量也与土壤细菌数量呈正相关关系。与对照组相比，接种S.luteus后根际土壤中变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、疣微菌门（Verrucomicrobia）和拟杆菌门（Bacteroidetes）的相对丰度均显著提高，优势属由原来的假节杆菌属（Pseudarthrobacter）转变为酸杆菌属（bacterium RB41）。接种S.luteus后土壤细菌丰度上升的属与其所对应的pH均呈负相关，表明樟子松和油松的生长喜好更偏向酸性环境。［结论］接种S.luteus不仅影响了根际土壤细菌群落结构，且有效改善土壤中养分的供应能力，为后续研究樟子松和油松退化机理提供理论基础。

关键词：褐环乳牛肝菌；土壤细菌；樟子松；油松

中图分类号Q939.96文献标识码A

文章编号0517-6611（2023）06-0148-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.06.036

Effects of Inoculation with Suillus luteus on Rhizosphere Soil Bacterial Communities of Pinus sylvestris var.mongolica and P.tabulaeformis

BAO  Runze，ZHANG Xing，YAO Qingzhi

（College of Life Sciences，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot，Inner Mongolia  010018）

Abstract［Objective］To investigate the effect of inoculation with the Suillus luteus on the interrhizosphere soil bacterial community structure of Pinus sylvestris var.mongolica and P.tabulaeformis.［Method］Using Illumina MiSeq highthroughput sequencing technology，we compared the bacterial community structure of the interroot soil of two pine trees under inoculation with S.luteus and without inoculation treatment，and also correlated with soil organic carbon （C），water content （WC），available phosphorus （P），and available nitrogen （N）.［Result］The contents of organic carbon （C），water content （WC），available phosphorus （P），and available nitrogen （N） in the rhizosphere soil of the two pine trees after inoculation with S.luteus were higher than those of the uninoculated control.Inoculation of S.luteus significantly affected the abundance of rhizosphere soil bacteria.The organic matter in the rhizosphere soil of the two pines was significantly positively correlated with the number of bacterial species，Shannon index，and ACE index in the rhizosphere soil，and the soil water content was also positively correlated with the number of soil microorganisms.The relative abundances of Proteobacteria，Bacteroidetes，Firmicutes，and Verrucomicrobia were significantly increased in the rhizosphere soils of the two pines after inoculation with S.luteus.The dominant genus changed from Pseudarthrobacter to bacterium RB41.The genus of increased abundance after inoculation with S.luteus was negatively correlated with its corresponding pH value.［Conclusion］Inoculation with S.luteus not only affected the bacterial community structure of rhizosphere soil，but also effectively improved the nutrient supply capacity of soil，which provided a theoretical basis for the subsequent study of degradation mechanism of P.sylvestris and P.tabulaeformis.

Key wordsSuillus luteus;Soil bacteria;Pinus sylvestris var.mongolica;Pinus tabulaeformis

根际作为植物根系与土壤间进行能量和物质交换的直接界面，是微生物栖息的主要区域，被认为是地球上最活跃的界面之一［1-4］。近年来，根际微生物组有关能促进植物宿主营养吸收、病虫害抵抗及胁迫适应的巨大潜力在相关研究中得到证实。根际微生物组内及与其他微生物组间的互作也影响微生物组的组装［5］。微生物间互作方式包括营养依赖（nutritional interdependencies）、协助扩散（enhanced dispersal）及群体感应（quorum sensing）等类型。其中特定细菌以真菌菌丝作为媒介，即利用所谓的“真菌高速公路（fungal highway）”来提高其在土壤环境中的迁移速度，是微生物间协助扩散的典型形式［6-8］。这一互作策略在构建土壤微生物网络中发挥重要作用。同时研究发现菌根辅助细菌（mycorrhiza helper bacteria，MHB）可以通过影响真菌菌丝的肌动蛋白细胞骨架进而导致菌丝形态的改变并提高菌丝延伸速度以达到提高侵染率的效果［9］。另外Kataoka等［10］利用5种外生菌根真菌（ectomycorrhizal fungi，EMF）对2种MHB的选择性辅助效应进行研究，发现MHB具有真菌选择性且作用机制存在差异。

随着生态建设的逐步深入，常绿针叶树种成为内蒙古地区造林、园林绿化的主要树种，在生态建设和环境恢复中发挥重要作用。樟子松（P.sylvestris var.mongolica）、油松（P.tabulaeformis）属深根性树种，其适应性强，耐旱、耐寒、抗瘠薄，是我国特有树种，也是内蒙古西部地区优良绿化树种［11］，且在干旱及半干旱地区对水源涵养和水土保持的意义重大［12-13］，随着苗木树龄增长和环境因子影响，目前油松和樟子松人工林面临林分环境变差、土壤肥力下降、林地生产力衰退等问题［14-15］，严重影响城市绿化观赏价值和防护林的生态价值。

EMF在改善植物根际微环境及促进宿主植物生长等方面发挥重要作用［16］。因此，笔者以接种S.luteus 5年后的樟子松和油松根际土壤为研究对象，利用分子生物学技术研究接种EMF对针叶树根际土壤细菌群落结构和多样性的影响，旨在为保障樟子松林和油松林的健康生长提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验地概况

研究区域位于内蒙古呼和浩特市和林格尔县，该地区地处阴山山脉，大青山南部（115°56′～115°60′E，42°25′～42°33′N），海拔为1 023～1 035 m。年平均降水量為410 mm，属于半干旱地区。

1.2样品的采集与处理

供试菌株Suillus luteus L22（GenBank登录号：OL872261）由笔者所在实验室前期分离自樟子松根系，菌株接种于PDA液体培养基培养20 d后制备成液体菌剂备用；供试苗木选自2012年内蒙古盛乐国际生态示范区苗圃，2年生的裸根苗，采用蘸根法接种S.luteus菌剂，共4种处理方式：接种S.luteus菌剂的樟子松bTZD；接种S.luteus菌剂的油松bTYD；不接种S.luteus菌剂的樟子松bTZM；不接种S.luteus菌剂的油松bTYM。于2017年5月上旬在每个处理样地设计3个样方（20 m×20 m），每个样方中选取5棵樟子松和油松作为重复（胸径为15 cm左右），每棵樟子松和油松选取3个方位，用无菌刷轻刷样品根系，并收集根际土于无菌塑封袋，将每个样方的5份根际土壤样品均匀混合成1份样品，最终得到12份土样。新鲜土样过10目钢筛后立即贮藏于-80 ℃冰箱内备用，用于后续检测。

1.3试验方法

1.3.1土壤DNA的提取与高通量测序。土壤DNA提取和测序分析在诺禾致源公司Illumina MiSeq PE250平台进行。

1.3.2土壤理化性质的测定。土壤含水量、有机质、速效氮和速效磷测定参考《土壤理化分析与剖面描述》［17］。

1.4数据分析

使用FLASH、Qiime及Mothur软件对原始数据进行过滤得到有效序列。基于Uparse在相似水平为97%的OTU进行聚类分析。用Mothur软件分析样品的Alpha多样性。利用SPSS 20.0分析群落结构与环境因子的相关性，利用CANOCO 5.0分析环境因子对细菌群落的影响；利用Praphpad Prism 8对试验数据进行可视化处理。

2结果与分析

2.1接种S.luteus对樟子松和油松根际土壤理化性质的影响

与未接种菌剂的樟子松和油松相比，bTYD、bTZD处理的根际土壤含水量、有机碳、速效磷、速效氮含量较高，此外，接种菌剂后的樟子松和油松根际土pH有所降低。表明S.luteus在樟子松和油松根际土壤的能量流动和养分循环中发挥了重要作用，同时也极大地促进了养分循环和关键元素的利用率（表1）。

2.2接种S.luteus对樟子松和油松根际土细菌群落的影响

不同处理下根际土壤细菌的分析（图1）表明，4个样品共获得7 853个细菌OTU，bTYD、bTZD、bTZM和bTYM细菌特有OTU数分别为304、262、795和202，表明接种后的油松根际土特有细菌OTU数大于对照组，而接种前的樟子松特有细菌OTU数远大于接种后，说明接种菌剂前后的细菌丰度有较大差异。

2.3Alpha多样性

对4种处理下的根际土壤样品进行了

16S rDNA多样性分析，各土样的细菌Coverage指数均高达

98%以上，说明该研究样品文库测序数据量合理，可以反映样本中微生物的真实情况。对照组的Simpson指数无显著变化（P>0.05）。从图2可以看出，有机质和物种数量、Shannon指数和ACE指数呈显著正相关（P<0.05），根际土壤含水量也与土壤微生物数量呈正相关关系。表明接种S.luteus显著影响了根际土壤细菌的丰富度（P<0.05）。

2.4土壤细菌群落结构分析

在门分类水平上，与对照组相比，bTYD、bTZD处理组根际土壤中拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）、疣微菌门（Verrucomicrobia）和厚壁菌门（Firmicutes）相对丰度均显著增加（P<0.05）；而丝状菌门（Actinomycota）、酸杆菌门（Acidobacteria）、古细菌门（Archaea）、绿弯菌门（Chloroflexi）和浮霉菌门（Planctomycetes）的相对丰度显明显降低（P<0.05）（图3）。

在属水平上，在bTYD、bTZD处理组中，孢菌属（Sphingomonas）、拟杆菌属（Bacteroides）、贪噬菌属（Variovorax）、地杆菌属（Pedobacter）、假单孢菌属（Pseudomonas）、单孢菌属（Terrimonas）、马赛菌属（Massilia）、溶杆菌属（Lysobacter）、根瘤菌属（Rhizobium）的相对丰度显著增大，而亚硝化球菌属（Nitrososphaera）、链霉菌属（Streptomyces）、隐盖氏菌属（Gaiella）和微枝形杆菌属（Microvirga）的相对丰度明显降低。此外，水恒杆菌属（Mizugakiibacter）只有在bTZD处理组的根际土壤样品中被检测到，相对丰度为0.69%。瘤胃球菌（Ruminococcaceae UCG-005）只在bTYD处理组的根际土壤样品中被检测到，相对丰度为0.36%（图4）。

2.5bTYD、bTZD主要属与理化性质相关性

总体来看，接种后的油松根際土壤细菌群落中，G55、Bacillu、Streptomyces、RB41、Microvirga和Solirubrobacter与含水量（WC）、速效磷（AP）、有机质（SOC）、速效氮（AN）呈正相关，其中RB41与AP、Solirubrobacter和SOC及AN之间呈极显著关系（P<0.01）（图5）。而Pseudomonas、Lysobacter、Ramlibacter和Teeeimonas的丰度在接种S.luteus后呈下降趋势。此外，丰度上升的属与pH呈负相关。

由图6可知，Steroidobacter、Mesorhizobium、Tardiphaga、Rhizomicrobium、Aquicella、Pseudohongiella、Hirschia、Terrimonas、Niastella与SOC、WC、AN和AP呈显著正相关（P<0.01）。而unidentified Planctomycetaceae在处理组bTYD、bTZD中的丰度呈下降趋势。丰度上升的属与pH呈负相关，综合以上结果猜测樟子松可能更适应在酸性环境下生长。

2.6环境因素相关分析（RDA分析）

物种多样性指数与土壤理化因子的RDA（redundancy analysis）分析结果显示，轴1（RDA1）和轴2（RDA2）对土壤细菌丰度与土壤理化因子关系的累计解释量为64.05%，能真实有效地反映土壤细菌群落和5个土壤理化因子的梯度变化。由图7可知，64.05%的群落结构信息可由这5个环境因子解释，土壤理化因子对细菌群落变异的解释率分别为77%、79%、77%、33%、14%，其中pH、WC、SOC的解释率为极显著（P<0.01），可见pH、有机质和土壤含水量是影响物种多样性指数变化的主要因子。此外，与bTYD、bTZD处理组根际土壤细菌群落结构组成高度相关的环境因子是AP，且为正相关。结果表明主要环境因素影响了微生物群落结构。

3讨论

土壤速效养分能够很好地反映土壤养分的存在状况。该研究结果表明，接种S.luteus能够提高速效养分在土壤中的积累，樟子松和油松根际土壤中速效氮较对照分别增加了54.76%和54.40%，速效磷较对照分别增加了58.49%和55.56%，土壤中速效氮、速效磷与土壤肥力的相关性较大，同时在保障植株正常生长发育方面起到重要作用。速效氮、速效磷含量显著提升是因为EMF能够直接或间接地活化土壤中的固定养分，促进土壤中难溶性磷、钾的溶解和释放，促进土壤中营养元素转化为植物可吸收的形态，从而显著提高了速效氮和速效磷的含量，提高了土壤速效养分的供应能力，改善了土壤中养分的供应状况，增加土壤肥力。且S.luteus还能产生植物激素类物质，刺激和调节作物生长，能激发土壤中固定的钙、锌等微量元素，使植物生长健壮，营养状况得到改善［18］。与此同时，速效磷还与樟子松和油松根际土壤细菌结构具有相关性，这可能是由于大部分解磷细菌为EMF的相关辅助细菌，接种S.luteus后其与土壤中的解磷菌互利共生，在提高解磷能力的同时也对土壤细菌群落产生了影响［19］。在后续研究中，可重点关注微生物网络互作，进一步对外生菌根的促生机理开展深入探究。

植物根际进行大量的物质交换和能量交换，而根际微生物多样性也与土壤肥力有显著相关性，所以根际土壤微生物群落结构和丰度是检测土壤健康及质量变化的关键指标［20-21］。所以研究不同促生菌接种条件下，植物根际土壤微生物数量的变化规律，对于探索植物对土壤的作用过程和促生机理具有重要作用［22］。Deng等［23］研究发现施加微生物菌剂会显著影响微生物数量及群落结构，这与该试验的结果相一致，可能是接种S.luteus后其次级代谢产物对一部分细菌的生长产生了抑制作用。Chao1指数和Shannon指数是分析和说明微生物多样性的关键指数，可以反映样本微生物的群落结构差异。在该试验中，接种S.luteus处理与根际细菌丰富度和多样性呈正相关关系，这在一定程度上反映出接种S.luteus菌剂使得樟子松根际土壤细菌群落结构稳定性提高。土壤微生物中以细菌体量最大，种类丰富，所以生物量也高；bTYD、bTZD处理组根际土壤细菌多样性提高，同时土壤关键营养元素含量升高，表明根际土壤肥力提升，其原因可能是一些植物促生菌影响了植物根系原本的代谢状态，导致根际微环境发生改变，最终使得根际微生物群落结构发生改变。在变化过程中，根际土壤细菌群落结构发生变化，同时优势菌群相对稳定。由此可知，促生菌在植物定殖后，可以在保证微生物群落健康稳定的情况下发生改变，进而改善土壤环境微生态和土壤肥力。此外，接种S.luteus对樟子松、油松根际微生物的影响中，变形菌门微生物反应较为敏感，而土传致病菌的重要组成部分为变形菌门，因此推测褐环乳牛肝菌有拮抗病原菌的能力［24］。

4结论

与对照组相比，接种S.luteus后根际土壤中Proteobacteria、Verrucomicrobia、Firmicutes和Bacteroidetes的相对丰度均显著提高，优势属由原来的Pseudarthrobacter转变为bacterium RB41。土壤中的速效养分含量提高；并发现有机质和物种数量、Shannon指数、ACE指数呈显著正相关。该试验结果表明EMF对供试苗木的根际土壤细菌种群的多样性和种群结构产生了影响，具体表现为一些细菌种类的增多、减少和数量上的丰富，而发生变化的细菌种类还有待进一步确定。该研究为提高人工林生态系统的稳定性，维持樟子松、油松人工林健康、稳定和可持续发展提供新思路。

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基金项目内蒙古自然科学基金项目（2020MS03044）；内蒙古自治区科技计划项目（2019GG002）；内蒙古农业大学生命科学学院创新团队项目（TD202103）。

作者简介包润泽（1998—），男，内蒙古通辽人，硕士研究生，研究方向：应用与环境微生物学。*通信作者，教授，博士，硕士生导师，从事林业土壤微生物学研究。

收稿日期2022-02-27