口服五维赖氨酸葡萄糖中盐酸赖氨酸含量的研究
2023-07-03谭菊英刘庄蔚
何 虹，谭菊英，刘庄蔚
（广西壮族自治区食品药品检验所，广西南宁 530021）
口服五维赖氨酸葡萄糖为口服复方颗粒剂，属维生素类非处方药，用于贫血、肝炎等慢性病所致的营养不良。盐酸赖氨酸（Lysine hydrochloride）是维持肌体氮平衡的8种必需氨基酸之一，能促进蛋白质的合成和代谢，有促进人体生长发育及智力发育的作用，尤为儿童发育期、病后恢复期、妊娠哺乳期所必需。由于谷物食品中的赖氨酸含量甚低，且在加工过程中易被破坏而缺乏，故称为第—限制性氨基酸。盐酸赖氨酸为口服五维赖氨酸葡萄糖主要组分之一，每g 样品中含盐酸赖氨酸1 mg。由于该品种的现行药品标准
[1]中未对盐酸赖氨酸的含量进行控制，为了更好地控制口服五维赖氨酸葡萄糖的质量，有必要增加盐酸赖氨酸含量的测定。现行中国药典中收载的盐酸赖氨酸测定方法为高氯酸非水滴定法[2]，高效液相色谱法[3-5]也常用于氨基酸测定，口服五维赖氨酸葡萄糖中除盐酸赖氨酸外，还含维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酰胺、泛酸钙和大量的葡萄糖、蔗糖等，各处方组分易对盐酸赖氨酸结果干扰。文献[6]建立用氨基酸分析仪的方法测定盐酸赖氨酸的含量，操作简单，干扰少，专属性强，可方便快速、准确地测定口服五维赖氨酸葡萄糖中盐酸赖氨酸含量，为该品种的药品质量提供保障。
1 实验部分
1.1 仪器、试药及样品
1.1.1 仪器
S-433D 氨基酸分析仪（德国Sykam 公司），XS205DU 电子天平（瑞士 Mettler-Toledo 公司），Milli-Q 超纯水仪（Millipore 公司）。
1.1.2 试药
对照品：盐酸赖氨酸（批号：140673-202010，以C6H14N2O2·HCl 计，含量为99.9%，中国食品药品检定研究院）。
试剂：盐酸（批号：20211126，国药集团化学试剂有限公司，分析纯）；甲醇（批号：217032，Fisher，色谱纯）；茚三酮（批号：20220117，国药集团化学试剂有限公司，优级纯）；氨基酸分析仪用缓冲液A、B，再生液和钾钠缓冲液（购于德国Sykam公司）。
缓冲液A：取二水合柠檬酸钠11.8 g，柠檬酸6.0 g，苯酚0.5 g，加水500 mL 溶解后，加甲醇65 mL，盐酸5.6 mL，辛酸0.1 mL，加水定容至1 000 mL（pH=3.45）。
缓冲液B：取二水合柠檬酸钠19.6 g，氢氧化钠3.1 g，硼酸5.0 g，加水500 mL 溶解后，加甲醇65 mL，辛酸0.1 mL，加水定容至1 000 mL（pH=10.85）。
再生液：取氢氧化钠20.0 g，乙二胺四乙酸（EDTA）0.4 g，加水溶解并定容至1 000 mL。
钾钠缓冲液：取三水乙酸钠272.0 g 和196.0 g 醋酸钾，加入300 mL 水溶解，边搅拌边加入200 mL 乙酸，超声完全溶解，放冷至室温并定容至1 000 mL（pH=5.51）。
1.1.3 样品
口服五维赖氨酸葡萄糖样品：共涉及4家企业[代号分别为C（10批）、F（27批）、H（36批）、S（23批）]，共计96批，为2022年国家抽检样品。
1.2 氨基酸分析仪测定条件
色谱柱LCA K06/Na，除氨柱：LCA K04/Na，流速：洗脱泵0.45 mL/min+衍生泵0.25 mL/min。柱温度：58～74℃梯度控温；茚三酮柱后衍生反应温度：135℃。进样量为50 μL；检测波长：570 nm，梯度变化过程见表1。
表1 盐酸赖氨酸含量测定方法梯度洗脱表
1.3 溶液的制备
1.3.1 对照品溶液
取样品10 包，研细混匀，精密称定，置50 mL量瓶中，加0.1 mol/L 盐酸溶液适量使其溶解后，并稀释至刻度，摇匀，精密量取2 mL，置20 mL 量瓶中，加0.1 mol/L 盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，经0.45 μm滤膜过滤，续滤液作为对照品溶液。
1.3.2 供试品溶液
取装量差异项下的样品，研细，取2 g 细粉，精密称定，置100 mL 量瓶中，加0.1 mol/L 盐酸溶液适量使其溶解后，并稀释至刻度，摇匀，经0.45 μm 滤膜过滤，续滤液作为供试品溶液。
1.3.3 空白溶液
取0.1 mol/L 盐酸溶液作为空白溶液。
2 结果与分析
2.1 方法学考察
2.1.1 专属性试验
通过发调研函收集到各企业的处方工艺和原辅料，为考察各辅料对盐酸赖氨酸的影响，按配制样品含盐酸赖氨酸为0.02 mg/mL 供试品溶液的处方配比量，照1.3.2供试品溶液的制备方法配制各种辅料溶液，照“1.2”项下色谱条件，记录色谱图，结果除蜂乳溶液检出盐酸赖氨酸，其他辅料溶液均未检出盐酸赖氨酸。空白溶液无干扰，供试品溶液中的未知峰对赖氨酸峰的分离度为7.2。色谱图见图1。
图1 专属性图谱
2.1.2 线性关系考察
称取盐酸赖氨酸对照品10 mg，精密称定，置50 mL 量瓶中，加0.1 mol/L 盐酸溶液适量使其溶解，并释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。分别精密量取0.1 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL，置不同的20 mL 量瓶中，加0.1 mol/L 盐酸溶液稀释刻度，摇匀，作为标准曲线溶液1～7。照“1.2”项下色谱条件，记录色谱图，以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，对其进行线性回归分析，结果：浓度1.15～34.62 μg/mL，回归方程为y=480 282x-12.755，相关系数r=0.9999，表明盐酸赖氨酸线性关系良好。
2.1.3 加样回收试验
取H 企业样品（批号220305）10袋，混合研细，取细粉1 g 各6份，精密称定，置不同的100 mL 量瓶中，加0.1 mol/L 盐酸溶液适量溶解，分别精密加入对照品储备液5 mL，加0.1 mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，过滤，作为加样回收溶液。照“1.2”项下色谱条件测定，结果：平均回收率为96.9%，RSD 为1.5%（n=6）。
2.1.4 重复性试验
取H 企业样品，取“2.1.3”项下细粉，按“1.3.2”供试品溶液的制备方法制备供试品溶液6 份测定，结果RSD 为1.5%（n=6），表明重复性良好，方法可行。
2.1.5 仪器精密度试验
取“1.3.1”项下的盐酸赖氨酸对照品溶液重复进样6针，结果6针RSD 为0.3%，表明仪器的精密度良好。
2.1.6 稳定性试验
取S 企业样品（批号1D2009047），按“2.1.3”加样回收试验操作配制稳定性溶液，照“1.2”项下色谱条件，在0、2.5、5、7.5、10、15、20、25 h 分别进样，记录色谱图，结果RSD 为1.8%（n=8），表明溶液在25 h 内稳定。
2.1.7 检出限和定量限试验
取“2.1.1”项下标准曲线1溶液，逐级稀释后注入氨基酸分析仪测定，至信噪比S/N 为10 ∶1为定量限，S/N 为3 ∶1作为检测限，计算所得的检出限为0.02 μg/mL，定量限为0.06 μg/mL。
2.2 样品中盐酸赖氨酸含量结果
取4家企业96批次样品，分别按“1.3.2”项下方法制备供试品溶液，再按“1.2”项下色谱条件测定，结果见表2。
表2 各厂家样品中盐酸赖氨酸的标示含量
3 结束语
3.1 样品测定结果分析
通过对96 批次样品按本方法测定盐酸赖氨酸的含量，结果仅有1 批在80%以上，有5 批结果在50%～80%，有36 批结果在20%～50%，有15 批结果小于10%，其余大部分结果在20%～10%。经统计分析，所有样品含量均值为24.7%，标准偏差为17.9%，H 企业及S 企业生产的含量结果普遍偏低，F 企业生产的含量结果比较分散，C 企业生产的含量结果较为集中。结果表明盐酸赖氨酸的含量与处方标示含量1 mg/g 严重不符。且盐酸赖氨酸的含量与批号呈相关性：批号越早，含量越低。
3.2 蜂乳问题
口服五维赖氨酸葡萄糖原处方中含蜂乳，2003年勘误修订：删去蜂乳成分。F 企业2022年2月前生产的样品仍加蜂乳，2月后生产的样品依据勘误删除蜂乳。S 企业生产的样品仍含有蜂乳。蜂乳为动物源性物质，富含蛋白质、氨基酸和多种元素，加入后会影响盐酸赖氨酸含量，可能会存在企业蜂乳替代盐酸赖氨酸投料或盐酸赖氨酸投料与标准中处方规定不符等现象。
3.3 含量偏低原因分析
通过对4家企业生产的口服五维赖氨酸葡萄糖中盐酸赖氨酸含量结果进行分析，结合企业提供的工艺流程，初步推测，造成盐酸赖氨酸含量偏低的原因，可能是由于处方中存在大量的葡萄糖，且企业采用湿法制粒、热风干燥等工艺，导致盐酸赖氨酸与葡萄糖发生了美拉德反应。美拉德反应[6-8]指的是含游离氨基的化合物和还原糖或羰基化合物在常温或加热时发生的聚合、缩合等反应造成样品中盐酸赖氨酸含量降低。因此，提示该品种的处方和工艺存在问题。建议生产企业改进工艺，优化处方，确保提供合格、优质的口服五维赖氨酸葡萄糖，满足人们用药安全有效。
