贝母药材中的生物碱类化学成分与药理活性分析

2023-07-03张素红张会丽

化工设计通讯 2023年6期

白玉，张素红，张会丽

（郑州工业应用技术学院药学与化学工程学院，河南新郑 451100）

贝母为多年生草本植物，其鳞茎供药用，能止咳化痰、清热散结。贝母药材作为常见的中药，其有效成分复杂，研究其药理活性，可在临床实践中发挥显著的作用。中药贝母的有效化学成分中，已分离检验出的生物碱化合物多达100余个，主要包括异甾体生物碱与胆甾衍生物。异甾体生物碱分为西藜芦碱类和介藜芦碱类；胆甾衍生物分为白藜芦碱类和茄次碱类。除此之外，川贝母中还含有皂苷、萜类、甾体、脂肪酸、嘌呤、嘧啶、烯烃类化合物、醇类化合物、呋喃类化合物、酮类化合物、烷烃类化合物和无机元素等多种成分。川贝母不仅具有良好的止咳化痰功效，而且能养肺阴、宣肺、润肺而清肺热，是一味治疗久咳痰喘的良药，因此，在许多治疗急性气管炎、支气管炎、肺结核等病症的中药方剂或中成药制剂中都有川贝，如蛇胆川贝露、川贝枇杷露等，以增强治疗疾病的效果[1]。基于生物碱及其药物活性的研究中，对其抗肿瘤药理活性进行研究，能够为贝母的临床药用价值提供参考。

1 材料和方法

1.1 一般材料

择取A549、NCI-H157、16HBE、SK-MES-1 及NCI-H460非小细胞肺癌（肺癌的常见临床分期，包括鳞状细胞癌、大细胞癌和腺癌，相比其癌细胞生长分裂较慢，扩散转移相对较晚）细胞株资料进行研究，通过 UHPLC-QTOF-MS/MS 结合细胞代谢组学技术观察贝母提取物对肿瘤细胞增殖的影响，从而明确贝母对不同种类非小细胞肺癌细胞株的抗肿瘤作用。

取手术切除获得的23例非小细胞肺癌组织，1 h内移植于NOD/SCID 小鼠或BALB/c 裸鼠皮下，观察移植瘤成瘤情况，测量移植瘤体积，绘制生长曲线图，计算成瘤率、成瘤潜伏时间和成瘤时间，分析并比较移植成瘤组和未成瘤组所对应患者的相关临床病理指标，并取移植成瘤组和所对应患者的组织标本进行病理学分析。

1.2 方法

将中药川贝母的果肉和果皮分开，通过比较不同提取溶剂、不同提取体积、不同提取方法制成待测样品，确定待测样品的最终制备条件。建立中药贝母待测样品的方法学，通过UHPLC-Q-TOF-MS 鉴定待测样品的主要成分，并测定小鼠试样血清中多种生物碱的浓度，计算其药动学参数。通过细胞侵袭实验与迁移实验，观察贝母提取物对A549、NCI-H157、16HBE、SK-MES-1 及NCI-H460 的迁移及侵袭力是否有抑制作用。

（1）将贝母粉碎，过80～120 目筛，加入原料量5～10 倍的50%～95%乙醇溶液，40～50 ℃浸渍提取3～5 次，合并提取液，真空浓缩至原体积的3%～10%，室温放置24 h，沉淀除糖，过滤，母液真空浓缩至干，加原料药量0.4～0.6倍的水溶解，所得溶液通过预处理的大孔吸附树脂吸附，流速0.8～1.2 mL/min，吸附完毕，先用水洗脱，洗脱液弃去，再用乙醇溶液洗脱，流速3.0～10.0 mL/min，至流出液无生物碱反应，减压浓缩，干燥，得贝母总生物碱。

（2）贝母提取物对不同种类非小细胞肺癌细胞株的药理活性的研究：培养非小细胞肺癌细胞A549、NCI-H157、16HBE、SK-MES-1 及NCI-H460，以不同浓度的贝母提取物为实验组，以等量的0.9%NaCl作为对照组，采用UHPLC-QTOF-MS/MS 结合细胞代谢组学技术观察贝母提取物对肿瘤细胞增殖的影响，并以流式细胞仪对细胞凋亡情况进行观察。

UVB 距小鼠30 cm 处照射。供试药物贝母生物碱提取物阳性对照药环耙明（cyclopamine），仪器UV 放射装置（Daavlin Co.，Bryan，OH），试验方法用B 波段UV 照射小鼠240 mJ/cm2一周三次，直至有明显可见的皮肤肿瘤出现，停止照射。口服给药20周，记录每周的肿瘤情况。然后取小鼠背部皮肤，以从组织学上研究肿瘤情况。于4℃将组织浸于0.2%戊二醛/2%甲醛-1*PBS 20 min，然后用1*PBS 洗两次。将组织在37℃置于含5%5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷的95%铁缓冲液中，放置24 h，以患基底细胞癌（BCC）表示部位的面积作为观察指标。

2 结果

2.1 本次配药方案

本次实验的配药方案见表1。

表1 本次实验配药方案

2.2 不同浓度的贝母醇提取物对肿瘤细胞的增殖抑制率

A549和NCI-H157的侵袭转移能力越强，16HBE及NCI-H460次之，而贝母药材中的生物碱类化学成分的抗肿瘤药理活性突出，见表2。

表2 不同浓度的贝母醇提取物对6种肿瘤细胞的增殖抑制率（%）

3 讨论

贝母的药理作用广泛，在已证实的药物活性研究中，具有显著的抗炎作用。贝母含有多种生物碱活性成分。既往研究的相关结果证实，贝母具有抗炎、抗肿瘤、降血压、神经保护、镇痛、抗氧化、药理活性涉及抗炎、镇痛、降压、平喘、抗血栓、胆碱酯酶抑制、抗病毒等作用[2]。

从表2 的结果中，表明了在同一种肿瘤的抗肿瘤研究中，基于中药贝母化学成分和药理作用的开发，在临床应用实践中具有突出的生物活性[3]。川贝母通过JAK-STAT 信号通路、PI3K-Akt 信号通路、MAPK 信号通路及鞘脂信号通路等多条通路，作用于EGFR、EGF、CDC42、RHOA、KRAS、CDK1、PLK1、CDK2、CCNB1靶点发挥治疗NSCLC 的作用。川贝母通过多种化学成分、靶点和通路的协同作用，发挥治疗哮喘和NSCLC 的作用。采用细胞代谢组学手段，分析了贝母非小细胞肺癌A549增殖的作用机制，找出了贝母主要成分中影响较大的代谢通路等生物过程[4]。伊犁贝母中含有丰富的化学成分，生物碱类成分为其主要活性成分。体外抗肿瘤活性筛选结果提示了伊犁贝母具有开发抗肿瘤新药的潜力，并在目标细胞株，尤其是肿瘤细胞株的抗肿瘤机制上，以不同的体外抑制活性实验，在不同化合物中的IC50值（衡量药物诱导凋亡的能力）抑制作用不同。抑制活性研究表明，对Hela 细胞的抑制效应突出，IC50值最高为16.9 μm。应用于甾体生物碱总含量的测定方法主要有分光光度法-酸性染料比色法、酶联免疫吸附法、滴定法等；包括HPLC-UV，HPLC-ELSD，HPLC-MS 和HPLC-CAD 等，为研究其药物活性提供了依据。

动物实验的研究表明，单次灌胃给药，确定小鼠的最小致死量为2 g/kg；具有一定舒张作用的受试物分别为：FPSA11、FPSA07、FPSA03、FPSA02、FPSA06、提取物Ⅰ、提取物Ⅱ；在初筛基础上进行了平喘功效的研究，受试物的拮抗作用从强到弱依次为：FPSA02 ＞氨茶碱、提取物Ⅰ、提取物Ⅱ＞FPSA07＞FPSA03、硝苯地平；伊贝母提取物0.5 g/kg 能够在延长咳嗽潜伏期、减少咳嗽次数、促进酚红分泌方面组间比较具有显著性差异。贝母生物碱可能通过调节细胞核受体活性、激活转录因子活性、调节G 蛋白偶联的神经递质受体活性、调节乙酰胆碱受体活性和类固醇激素受体活性等发挥作用；KEGG通路分析显示，平贝母生物碱可能通过TNF 信号通路、IL-17 信号通路、NF-κB 信号通路、MAPK 信号通路等发挥作用。分子对接结果显示，平贝母生物碱与抗炎蛋白具有较低的结合能。贝母总生物碱、总核苷抑制P-gp 的外排活性，呈现浓度依赖性；浙贝母总生物碱、总核苷低剂量组Calcein 荧光比率为（134.96±11.91）%、（126.89±10.42）%，显著高于空白组（100.00±11.49）%（P＜0.05）。浙贝母总生物碱、总核苷高剂量组Calcein 荧光比率为（209.72±9.44）%、（162.42±7.83）%，显著高于空白组（100.00±11.49）%。浙贝母总多糖低、高剂量组与空白组无显著差异。

从药物活性化作用来讲，贝母具有多种药理活性，其提取物及活性成分具有止咳，化痰，平喘，解痉，镇静，弛豫回肠，抗肿瘤，扩瞳，兴奋子宫，正性肌力，降血压，抗凝，扩张冠状动脉的突出功效。贝母属植物中含有许多类化学物质，如生物碱类、皂苷类等，通常认为贝母生物碱是其主要有效成分，为评价贝母质量，常通过贝母生物碱的含量高低作为活性强弱的关键性标识。贝母生物碱提取物在制备治疗基底细胞癌及其他肿瘤药物中的应用，其作为中药材的机理主要是通过区分出肿瘤细胞，并使其死亡，从而达到治疗效果。同时能保留正常的组织细胞（包括正常表皮基层和毛囊的未被区分的其他细胞）。由于贝母生物碱提取物引起肿瘤细胞死亡的原因是通过非基因毒性机制，因此不同于放射治疗和化学疗法那样，它们是通过破坏DNA 来发挥作用，对正常细胞也带来了杀伤。依据该机理，贝母生物碱提取物特别适用于癌症治疗，能治疗基底细胞癌以及其他如髓质母细胞瘤、横纹肌瘤、纤维肉瘤、消化道肿瘤和小细胞肺癌等通过hedgehog/圆滑信号传导途径来繁殖细胞和防止细胞凋亡的肿瘤。总之，结合表2和相关学者的资料，证实了贝母药理活性作用效果突出，不同浓度的提取物的实验结果和药理作用分析等表明了该药物在临床抗肿瘤研发领域的突出优势。