新疆奇台县马铃薯疮痂病病原的分离鉴定及生物学特性

刘晓禄　冶海林　刘易　艾尼江?尔斯满　徐李娟　郭瑞　包晓玮　宋素琴

摘要：对新疆奇台县马铃薯瘡痂病病原菌进行分离、鉴定和生物学特性研究，从该地区采集马铃薯种植区病薯块茎及根际土壤，利用植物组织分离法、稀释涂布分离法分离菌株，并检测致病基因txtAB、nec1、tomA，结合小萝卜幼苗法和小薯片法测定菌株的致病性；通过形态学、生理生化特性及16S rDNA序列进行鉴定。结果表明，菌株5-51和B4K3-21具有txtAB致病基因；小萝卜幼苗抑制率分别为73.55%、77.20%，能使小薯片表面变褐，坏死；菌株K1-4和T6同时具有txtAB、nec1、tomA等3种致病基因，小萝卜幼苗抑制率分别为80.86%、77.42%，均能使小薯片和萝卜片表面变褐、坏死且具有较强的致病性。生物学测定发现菌株K1-4、T6、5-51、B4K3-21能以D-葡萄糖、α-乳糖、蔗糖、D-果糖、肌醇、D-甘露醇为单一碳源，以L-赖氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸为单一氮源，经16S rDNA 序列分析，菌株K1-4、T6、5-51与Streptomyces galilaeus（MK 424308.1）的亲缘关系最近，相似率为99.86%，菌株B4K3-21与 Streptomyces europaeiscabiei（NR116533.1）的亲缘关系最近，相似率为99.64%，表明新疆奇台县马铃薯疮痂病的病原菌为Streptomyces galilaeus和Streptomyces europaeiscabie，均为新疆首次报道。

关键词：新疆奇台；马铃薯疮痂病病原菌；分离鉴定；致病基因；生物学特性

中图分类号：S435.32文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2023）05-0139-07

马铃薯（Solanum tuberosum）为茄科一年生草本植物，是全球第四大重要的粮食作物［1］。新疆马铃薯种植区面积达到2.44万hm2，约占全国总种植面积的5%，南疆地区马铃薯种植面积约为 8 000 hm2，而北疆地区为1.64万hm2，主产县为昌吉州地区的奇台县和木垒县。近年来，随着马铃薯种植面积的扩大，马铃薯疮痂病（potato scab）已成为新疆奇台县马铃薯主要病害之一。

马铃薯疮痂病是由链霉菌（Streptomyces spp.）引起的土传和种传病害，病薯症状主要表现为在马铃薯表面形成褐色木栓化病斑，严重时呈疮痂状，这就严重影响了马铃薯外观品质以及市场价值［2-3］。引起马铃薯疮痂病的病原菌有S. acidiscabies、S. europaeiscabiei、S.scabies、S. galilaeus，其中S.scabies和S. acidiscabies是引起马铃薯疮痂病的主要病原菌［4-7］，自2000年以来不同国家报道有30多种致病菌种类［8-10］。致病菌种类通常以链霉菌的形态、生理生化和分子学特征为鉴定依据［11-13］。其中，引起马铃薯疮痂病的主要因子是Thaxtomin A毒素分子，Thaxtomin A是一种二酮哌嗪类化合物，是一种纤维素合成抑制剂，纳摩尔级别的Thaxtomin A就可引起植物根部受到抑制，疮痂链霉菌相关致病基因均聚集在一个致病基因岛（pathogenicity island，简称PAI）上，可水平转移到其他非致病性链霉菌中，从而导致新致病菌的出现。PAI中含有致病基因txtAB（Thaxtomin A合成相关基因）以及nec1和tom A等与致病性相关的基因［14］。目前已有包括16S rDNA序列分析、MLSA多序列位点分析的多种分子生物学技术用于链霉菌的分类鉴定。张萌等对来自我国不同地区的马铃薯疮痂病病原菌进行遗传多样性分析和区域分布特性研究，表明S. bobili和S. galilaeus主要分布于内蒙古自治区、河北、山西等地，S. europaeiscabiei和S. scabies主要分布于河北、黑龙江、新疆维吾尔自治区等地。新疆奇台县紧邻天山，适宜马铃薯常年种植，近年来随着新疆马铃薯病原种的调入，疮痂病发生日益严重，逐年呈现恶化趋势［15-17］。2010年仅在伊犁地区报道的病原菌为S.scabies和S.acidiscabies等2种［18］，由于地域条件和环境的差异，不同区域或同一地区往往在不同季节盛行不同的疮痂病原链霉菌［19-20］。新疆奇台地区马铃薯疮痂病的研究还未见报道，本研究旨在对奇台地区马铃薯疮痂病病原进行分离鉴定及生物学特性分析，为系统研究新疆马铃薯疮痂病病原的种类及该病害防治提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试马铃薯疮痂病病薯块茎和根际土壤于2021年8月采自新疆奇台县半截沟镇。对照菌株：Steptomyces scabies YN由云南农业大学提供。

分离培养基为燕麦麸皮培养基（OMA）：20 g燕麦麸皮、15 g琼脂和1 L去离子水；高氏一号固体培养基（G1）：20.0 g可溶性淀粉，0.5 g磷酸氢二钾，1.0 g硝酸钾，0.5 g氯化钠，0.01 g七水硫酸亚铁，0.5 g七水硫酸镁，20.0 g琼脂粉，1 L去离子水。

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌的分离纯化

将采集自不同地段的患病马铃薯及根际土拍照保存记录（图1）。病薯块茎用水反复冲洗，之后用灭菌水冲洗，用灭菌过的解剖刀切取块茎病健交界处5 mm2左右的组织块，用0.3%次氯酸钠溶液浸泡组织块30 s，灭菌水冲洗3遍，用无菌滤纸吸取残余水分，切成厚度为 1.2 mm 的小片，置于OMA培养基上28 ℃培养7 d；挑取单菌落在OMA培养基上划线纯化3次，得到纯化后的菌株［21］。

将采集的马铃薯疮痂病发病地块土壤于自然条件下风干1 d，用无菌研钵研细，利用稀释涂布法，称取1 g根际土壤，加9 mL无菌水，涡旋混匀，静置30 min后进行101、102、103倍梯度稀释。取50 μL混悬液分别涂布于OMA培养基上，28 ℃培养7 d。挑取单菌落在OMA培养基上纯化并编号，纯化菌株转接斜面置于4 ℃冰箱保存。

1.2.2 病原菌的致病基因測定

根据报道，产生链霉菌致病性的基因，包括参与 thaxtomins类生物合成的致病基因（txtAB）、坏死基因（nec1）和番茄红素酶基因（tomA）通常聚集在一个致病岛（PAI）中，是参与菌株致病全过程的毒性因子，将病原菌是否含有txtAB基因作为该菌是否具有致病性的检测指标［22］。通过PCR扩增的方法，检测链霉菌中是否含有致病基因。以对照菌株S. scabies YN为阳性对照，对txtAB、nec1、tomA基因进行检测。致病基因检测PCR反应体系见表1，引物序列如表2所示，扩增条件如表3所示，PCR扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.2.3 病原菌的致病性测定

利用小薯片法、萝卜苗法测定含有致病基因的链霉菌菌株的致病性［26-27］。

1.2.4 病原菌的形态学及生物学特性

病原菌形态特征观察：挑取OMA平板上生长5 d的链霉菌单菌落置于载玻片上，40×光学显微镜下观察链霉菌孢子形态特征。根据国际链霉菌计划（ISP）方法，进行生理生化鉴定。

1.2.5 16S rDNA序列分析菌株基因组DNA的提取参照文献［28］中的方法进行。采用16S rDNA通用引物，通用引物为27F、1492R，PCR反应体系为30 μL：15 μL Mix，2 μL模板，ddH2O 11 μL，上下游引物各1 μL，利用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。由生工生物工程（上海）股份有限公司进行测定。测序结果在NCBI网站上比对，利用Mega7.0构建发育树。

2 结果与分析

2.1 马铃薯疮痂病病原菌的分离

马铃薯块茎病健交界处组织和马铃薯根际土壤中共分离纯化得到97株放线菌，其中链霉菌32株，对分离得到的菌株进行初步归类并编号。

2.2 马铃薯疮痂病病原的致病性测定

2.2.1 病原菌的致病基因PCR检测

根据致病基因测定方法，对筛选得到的链霉菌进行致病基因检测，结果表明，4株链霉菌具有致病基因，其中2株具有txtAB基因，K1-4和T6同时具有txtAB、nec1、tomA等3种致病基因（图2）所示。

萝卜幼苗法表明，致病链霉菌菌株均能抑制萝卜幼苗的生长，其中K1-4菌株抑制率达到80.86%，仅次于阳性对照菌株（表4）。与空白对照组相比致病菌株菌悬液处理组小萝卜幼苗的根部和苗明显受到抑制且部分有坏死现象（图3）。因此，4株致病性链霉菌菌株均具有较强的致病性。

利用小薯片法和萝卜片法对具有致病基因的4株菌株进行致病性测定，7 d后可观察到萝卜片中央有坏死现象，薯片表面变褐有凹陷，而对照的小薯片和萝卜片无变化（图4）。

2.3 病原菌的形态学鉴定

2.3.1 形态学描述

菌株T6、K1-4、5-51、B4K3-21 等4种菌株在OMA平板上形态特征见图5。T6、K1-4、5-51菌落呈灰白色， 边缘稍有褶皱突起，呈同心圆状，革兰氏染色呈阳性，孢子呈灰色，孢子链呈直柔曲状（图5）。B4K3-21菌落呈白色，革兰氏染色呈阳性，孢子呈白色。

2.3.2 病原菌生物学特性的测定

各菌株生物学测定结果见表5。菌株K1-4、T6、5-51、B4K3-21均能以D-葡萄糖、α-乳糖、蔗糖、D-果糖、肌醇、D-甘露醇为单一碳源，以L-赖氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸为单一氮源，对结晶紫和苯酚敏感，在含10％的NaCl培养基中无法生长，均能产生黑色素、H2S和淀粉酶（表5）。

2.3.3 病原菌的16S rDNA序列分析

采用细菌通用引物，对分离到的链霉菌菌株进行扩增，得到长度为1 500 bp的16S rDNA片段（图6），本研究选取K1-4、T6、5-51、B4K3-21的16S rDNA片段送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。通过在NCBI GenBank中进行BLAST比对，证明以上4个菌株均为链霉菌的16S rDNA序列。系统发育树结果显示（图7、图8），菌株K1-4、T6、5-51 与Streptomyces galilaeus（MK 424308.1）的亲缘关系最近，相似率为99.86%。菌株B4K3-21与Streptomyces europaeiscabiei（NR116533.1）的亲缘关系最近，相似率为99.64%，结合形态学特征，将其初步鉴定为S. europaeiscabiei。

3 讨论

马铃薯疮痂病的主要传播方式为种薯和土壤传播，其中带病种薯的区域间调拨是致使不同种疮痂病病原菌大范围扩散的主要原因。在鉴定病原菌的过程中，各生物学特性可能存在地域性差异，不同地区间相同种属的不同菌株亦可能存在差异，因此要尽可能选取更多的生物学指标进行系统分析。国内对马铃薯疮痂病病原菌的相关研究较晚，截至目前我国已报道的疮痂链霉菌病原共计18种，在河北省鉴定出3个致病种——S. diastatochromogenes、S. europaeiscabiei和疮痂链霉菌［29］；在黑龙江省鉴定出4个致病种——普通疮痂链霉菌、酸式疮痂链霉菌、肿痂链霉菌和欧式疮痂链霉菌［30］；新病原菌的不断出现表明我国疮痂链霉菌的病原组成具有多样性。

由于链霉菌种类受环境和气候影响较大，因此明确当地马铃薯疮痂病病原菌的种类，才能更有效地制定病害防控措施。

本研究对新疆奇台地区分离出的病原菌菌株进行生物学特性和16S rDNA序列分析，将造成新疆奇台县的马铃薯疮痂病的病原鉴定为S. galilaeus和S. europaeiscabie，研究发现S. galilaeus的致病力仅次于S. scabies。在前人研究中，对伊犁地区马铃薯疮痂病病原进行分离鉴定到S. acidiscabies、S. scabies等2种疮痂链霉菌，其中分离到的S. acidiscabies致病性较强，对小萝卜幼苗抑制率为70.6%。

本試验在新疆奇台县分离到2种病原菌分别为S. galilaeus和S. europaeiscabie，其中S. galilaeus K1-4、T6和5-51菌株的萝卜苗抑制率分别为80.86%、77.42%、73.55%，S. europaeiscabie B4K3-21 对小萝卜幼苗抑制率为77.20%，致病性明显高于酸式疮痂链霉菌，且这2株菌为新疆首次报道的病原菌，通过对特定地区马铃薯疮痂病病原菌的分离和鉴定，可为新疆奇台地区马铃薯疮痂病的防治提供理论依据。

4 结论

以新疆奇台县马铃薯种植地采集的土壤和病署块茎为研究对象，经形态学及16S rDNA序列同源性分析初步鉴定该菌株与S. galilaeus和S. europaeiscabie同源性相近，均为新疆首次报道的马铃薯疮痂病病原菌。致病基因PCR扩增试验筛选得到4株具有致病基因的菌株，其中K1-4和T6同时含有3种致病基因txtAB、tomA、nec1。致病性试验证实，菌株K1-4、T6、5-51、B4K3-21均可以抑制萝卜幼苗的生长，使小薯片表面变褐有凹陷，小萝卜片表面坏死，而对照无发病现象。生物学特性显示菌株K1-4、T6、5-51、B4K3-21能利用D-葡萄糖、α-乳糖、蔗糖、D-果糖、肌醇、D-甘露醇6种碳源，能利用L-赖氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸等3种氮源，对苯酚和结晶紫敏感，在含10％ NaCl培养基中不能生长，均能产生黑色素、H2S和淀粉酶。

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收稿日期：2022-07-24

基金项目：新疆维吾尔自治区重点研发任务专项（编号：2022B02044-2）；新疆农业科学院科技创新重点培育专项（编号：Xjkcpy-202203）；农业农村部西北荒漠绿洲作物有害生物综合治理重点实验室开放基金（编号：KFJJ202006）。

作者简介：刘晓禄（1997—），男，新疆奇台人，硕士研究生，主要从事微生物活性产物研究。E-mail：1738634315 @qq.com。

通信作者：包晓玮，博士，教授，主要从事食品营养与安全研究，E-mail：408531623@qq.com；宋素琴，硕士，研究员，主要从事微生物活性产物及作物病害研究，E-mail：suqin_song@163.com。