包包曲风味萃取方式的对比及GC×GC-TOFMS在其风味化合物鉴定中的应用

陈 荻，杨康卓，刘志鹏，赵 东，2，3，郑 佳，2，3

（1.宜宾五粮液股份有限公司技术研究中心，四川宜宾 644000；2.固态发酵资源利用四川省重点实验室，四川宜宾 644000；3.中国轻工业浓香型白酒固态发酵重点实验室，四川宜宾 644000）

“曲乃酒之骨”，曲不仅是白酒酿造所需的糖化剂，同时也是生香剂，对酒的品质和风味形成尤为重要[1]。研究表明，曲的风味影响酒的风味，作为酿造原料的一部分，其所含的大量风味物质及风味前体物质在酿造过程中直接或间接地进入酒体，对中国白酒的香型、风格和流派有着深远的影响[2，3]。同时，酒曲风味反映其品质，是白酒生产过程中的关键控制指标。由此可见，酒曲风味的研究对白酒风味形成机理的探究及实际生产中酒曲质量的控制都具有重要意义。五粮液所用大曲俗称包包曲，属于中高温曲，包包曲的曲香浓郁，发酵力及糖化力强，是五粮液优越香气的奥秘之一[4]。

全二维气相色谱飞行时间质谱技术（GC×GCTOFMS）将两根不同极性的色谱柱连接起来，分析物从一维色谱柱流出后进入二维色谱柱进行二次分离，因此具有灵敏度高、分辨率高、峰容量大等特点，是复杂样品中风味分析的有效手段[5-7]。GC×GC-TOFMS 在白酒、葡萄酒、啤酒、奶酪、咖啡等食品风味分析领域的应用越来越广泛[6，8-10]。郑佳等[2]应用GC×GC-TOFMS 研究了包包曲的蒸馏香气成分，发现该技术对大曲中含量较低的吡嗪、硫化物等物质具有优越的检出和鉴定能力，且鉴定化合物的总数远高于一维GC[11-15]，但相关样品前处理方法仍有进一步优化的空间。样品前处理的目的是提取并浓缩其中的风味成分，大曲的风味萃取方法包括液液萃取（LLE）、顶空固相微萃取（HS-SPME）、溶剂辅助蒸发萃取（SAFE）、搅拌棒吸附萃取、索氏提取等，其中HS-SPME 的应用最为普遍[16]，目前尚未有针对这些方法的对比研究。

因此，本研究的目的是对比LLE、HS-SPME、SAFE 等方法在包包曲风味成分萃取中的效果，并利用GC×GC-TOFMS 建立针对包包曲风味的有效分析方法，对科学认识包包曲中曲香的组成具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

1.1.1 试验材料

生产用曲粉，采自宜宾五粮液股份有限公司酿酒车间。

1.1.2 试剂及耗材

二氯甲烷、乙醚均为HPLC 级，购自百灵威公司；正戊烷，分析纯，购自成都科龙化工厂；无水硫酸钠、无水氯化钙均为ACS 级，购自阿拉丁公司；氯化钠，GR 级，购自阿拉丁公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头，购自美国Supelco公司。

1.1.3 仪器设备

全二维气相色谱-飞行时间质谱仪由Agilent 7890B 气相色谱（Agilent Technologist，美国）、Pegasus 4D 飞行时间质谱仪（LECO，gouzi 美国）和多功能自动进样器（Gerstel，ML2，德国）组成；调制器（LECO，美国）为液氮型调制器；全二维气相色谱由一维气相色谱柱箱和安装在其内的独立控温的二维色谱柱箱构成。一维色谱柱为极性柱DB-WAXext（30 m×0.25 mm×0.25 μm，J&W，美国），二维色谱柱为中等极性柱Rxi-17Sil MS（2.0 m×0.1 mm×0.1 μm，Restek，美国）。

1.2 试验方法

1.2.1 香气成分提取

1.2.1.1 HS-SPME方法

HS-SPME 分为湿法[12]和干法[17]，湿法HSSPME 向15 mL 顶空瓶添加5 mL 饱和食盐水和2 g曲粉，干法HS-SPME 只添加2 g 曲粉，水浴50 ℃平衡10 min，采用经过老化的萃取头吸附30 min，最后在进样口230 ℃下解吸附5 min。

1.2.1.2 LLE方法

称取20 g 曲粉于烧杯中，加入0.2 g 氯化钙及50 mL 去离子水，用封口膜封口，冰浴超声过夜，冷冻离心取上清液，加入等体积乙醚戊烷混合液（1∶1）萃取3 次，冷冻离心破乳，合并上层萃取相，加入0.5 g 无水硫酸钠除去多余水分，氮吹浓缩至500 μL[18]。

1.2.1.3 SAFE方法

称取20 g 曲粉于50 mL 蓝盖瓶中，加入20 mL二氯甲烷萃取3 次，离心后合并萃取液，在50 ℃，1×10-3pa 条件下进行SAFE 处理以除去多余油脂和色素，收集萃取液，氮吹浓缩至500 μL[19]。

1.2.2 GC×GC-TOFMS条件

GC 条件：进样口温度230 ℃，一维柱箱起始温度45 ℃，保持3 min，再以5 ℃/min 升温至230 ℃并保持10 min。GC 二维柱箱全程保持比一维柱箱高5 ℃。调制补偿温度20 ℃。调制周期为4 s（热脉冲时间0.8 s）。色谱柱采用恒流模式，载气为高纯氦气（纯度＞99.999%），流速为1 mL/min。进样口为不分流进样方式，进样量为1 μL。

TOFMS 条件：GC 连接线温度240 ℃，电离电压-70 eV，离子源温度230 ℃，检测器电压1500 V，质量数范围35～400 amu，数据采集频率100 spectra/s。

1.3 数据处理

参考文献所述方法[20]，采用ChromaTOF软件进行自动解卷积和谱库（mainlib,standards,NIST 和replib）比对，选择相似度大于800、信噪比大于50的组分，比较实验分析中和文献中的保留指数，结合香气成分标准物质的保留时间进行物质的综合鉴定。根据各化合物峰面积占比计算其相对百分含量。

2 结果与分析

2.1 二维总离子流图

包包曲的风味萃取除了注重风味成分的萃取效率之外，还需要考虑色素及油脂的去除，因此，研究采用了LLE、HS-SPME、SAFE 等多种萃取方法对包包曲中的风味成分进行萃取。HS-SPME 由于没有溶剂萃取的过程，因此不存在油脂和色素的干扰，LLE 和SAFE 的萃取结果显示，SAFE 能完全去除样品中的油脂和色素，LLE 的浓缩样品则呈极轻微的透明的黄色，样品中残留了一定色素。

图1 为包包曲的风味成分二维总离子流图。由图1 可知，经过多种前处理方法提取结合GC×GC-TOFMS 分析后，检出大量挥发性组分，证明包包曲的风味组成十分复杂。图中LLE 萃取所得的风味物质种类及含量明显高于其他方法。对二维总离子流图采用Pegasus 4D 飞行时间质谱仪自带工作站软件ChromaTOF 对照NIST 质谱库检索解析，再结合标品质谱和保留时间、文献保留指数等综合对比，得到所有化合物的鉴定结果。数据显示LLE、SAFE、HS-SPME-WET、HS-SPME-DRY 样品中鉴定出的物质分别为316 种、172 种、176 种、217 种，均远远超过大曲样品一维GC-MS 的鉴定数量[11-15]。LLE 和SAFE 的萃取效果都受萃取剂影响，两者萃取剂并不相同，除此之外，SAFE 蒸馏过程中容易损失难挥发物质；两种HS-SPME 方法则受到样品量及萃取头吸附性的限制。

图1 包包曲风味物质的二维总离子流图

2.2 风味化合物数量

不同萃取方法对不同种类化合物的萃取效率不同，因此，为了分析不同萃取方式的特点，对四组样品中的化合物进行了归类，图2 为不同样品中化合物的分布。结果显示，醇类是所有样品中数量最多的化合物（“其他”包含化合物种类较多），醇类在数量上的优势在以往关于包包曲[2，11]乃至酒曲[13]的研究中均有报道。就萃取方法而言，LLE 萃取样品中，除了酯类，其他种类化合物都比其他方法丰富，体现了其在整体萃取效率上的优势，推测原因为相较于SAFE，LLE 萃取过程简单，损失更少，相较于HS-SPME，LLE 会检测到更多难挥发的物质。SAFE 除色素和油脂的效果最佳，但在萃取化合物的丰富程度上不具优势。HS-SPME-DRY 的萃取效果优于HS-SPME-WET，具体体现在酯类、醛类和芳香族化合物的数量上，郭兆阳等[21]研究指出，氯化钠会抑制大曲中组分溶出，这可能是HSSPME-WET 鉴定化合物少于HS-SPME-DRY 的原因。

图2 包包曲中各类型化合物数量

2.3 风味化合物含量

经统计，LLE、SAFE、HS-SPME-WET、HSSPME-DRY 萃取样品在二维上的总峰面积分别为44806322、31958804、11364129、24827363，总体萃取效率 LLE＞SAFE＞HS-SPME-DRY＞HSSPME-WET。实验采用峰面积归一法定量，图3 为不同样品中化合物峰面积占比的统计结果。峰面积的比较，进一步凸显了醇类在包包曲风味成分中的优势，说明包包曲中的醇类不仅种类多，含量也高。相反，硫化物在各方法中的峰面积占比都较低。除此之外，各个方法呈现出不同的特点，LLE萃取得到的酸类、呋喃和其他类化合物占比明显高于其他方法。分析认为，酸类普遍沸点较高，因此在损失最少的LLE中得以保留最多，呋喃和其他类化合物则可能因为该方法整体萃取效率高，使数据库准确鉴定到了更多相关化合物；两种HS-SPME方法萃取得到的醛类占比都高于其他方法，说明该方法对醛类的吸附性强，其物质分布与已有报道相符[22]。

图3 包包曲中各类型化合物峰面积占比

2.4 典型风味成分的检出

由图2、图3 可知，各萃取方法对包包曲主要香气成分醇、酸、酯、醛、酮、芳香族等都有较好的提取能力，因此，吡嗪、硫化物等低含量物质的检出效果成为判断方法好坏的关键。

吡嗪主要由大曲发酵过程氨基酸、蛋白质等发生美拉德反应产生或褐变反应产生，除此之外，也可以由微生物在曲药中迅速繁殖并代谢产生[23]。吡嗪类化合物是一类对白酒风味形成有重要贡献的微量化合物，也是白酒中重要的功能性成分[24]，这类物质主要呈现巧克力、坚果、花生味等香气，被认为是大曲中焦香味、烘焙味的主要来源[1]，各方法检出吡嗪的数量分别为LLE 13 种，SAFE 5 种，HSSPME-WET 11 种，HS-SPME-DRY 11 种，可见LLE 具有优势。LLE 检出的典型吡嗪物质包括吡嗪、2-甲基吡嗪、2-乙基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-乙基-3,5,6-三甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪、2-甲基-6-乙烯基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪等，均为大曲中典型的吡嗪类化合物[2，11，19，25]。

表1 包包曲中的吡嗪化合物

表2 包包曲中的硫化物

硫化物在白酒或大曲中的含量都比较低，硫化物的阈值极低，具有强烈的洋葱、大蒜、臭鸡蛋或者烂白菜味道，硫化物在浓度较低的情况下，对白酒的风味起着有利作用[26]。各方法检出的硫化物数量 分别为LLE 4 种，HS-SPME-WET 2 种，HSSPME-DRY、SAFE 均为1 种，可见，LLE 在硫化物检测方面也具有优势。

就单个化合物讨论，2,3-丁二醇在所有方法中峰面积占比都大于1%，尤其在LLE 和SAFE 中，占比分别达到了15.80%和36.86%，杨理章等[15]在采用LLE 萃取高温大曲中的风味物质研究中也指出了这一现象。同时，苯乙醇、丙二醇、醋酸、己酸、丁内酯的占比也在不止一种方法中超过了1%，这与前人关于包包曲风味的研究结论相符[2，11]。此外，正己醇和2-戊醇只在两种HS-SPME 方法中含量超过1%，这可能与方法的选择性有关。

3 结论

本研究采用GC×GC-TOFMS 技术检测包包曲中的香气成分，多方面对比了LLE、SAFE、HSSPME 等多种方法在包包曲风味萃取中的效果。结果显示，LLE、SAFE、HS-SPME-WET、HSSPME-DRY 样品中鉴定出的物质分别为316 种、172 种、176 种、217 种。LLE 在化合物总峰面积、化合物数量、低含量物质的检出方面都具有优势，但样品中残留一定色素。SAFE能完全去除油脂和色素，但在蒸馏过程中可能存在风味成分的损失。干法HS-SPME对包包曲风味成分的萃取效果优于湿法HS-SPME，两者对比其他方法对醛类表现出更好的吸附性。此外，醇类在包包曲中数量最多，含量最高；就单个化合物而言，2,3-丁二醇、苯乙醇、丙二醇、醋酸、己酸、丁内酯等在包包曲中相对含量较高。本研究可为包包曲乃至酒曲的风味研究提供数据基础及方法参考。