单间作小麦响应白粉病菌侵染的差异代谢物及代谢通路*

陈 升,吴鑫雨,何建杨,周 懂,刘振洋,汤 利,郑 毅,2,肖靖秀**

(1.云南农业大学资源与环境学院 昆明 650201;2.云南开放大学 昆明 650233)

小麦(Triticum aestivumL.)是世界上重要的粮食作物。小麦白粉病(Blumeria graminisf.sp.tritici)是直接影响小麦减产的真菌性病害;在我国小麦种植区,白粉病通常会造成10%～50%的产量损失[1-3]。氮(N)是植物重要的矿质营养元素,直接影响小麦白粉病的发生及病害的严重程度[4-5]。前人从氮素调控群体结构、改变植物生理生化过程等系统解析了氮介导小麦白粉病发生的机制[6-7]。当氮素供应过多时,小麦群体结构增大、细胞壁木质素合成减少、质外体和叶表面的氨基酸及酰胺浓度增加、酚类物质合成减少,植株抗病性下降、病菌侵染和繁衍增加[6]。氮素调控小麦抗性的分子和生理机制尚需深入研究。

代谢组学是研究植物应对外界刺激反应的一种方法[8],它可以通过对生物体的组织、细胞、甚至整个生物体的分析得到不同的代谢组学特征[9],可以作为有效的工具识别宿主对生物胁迫的生化反应和病原体代谢途径[10]。前人利用代谢组学方法从代谢物种类差异的角度揭示了小麦抗赤霉病[11]和条锈病[12]的分子机制。但目前利用代谢组学方法解析氮调控小麦白粉病抗性的生理代谢机制还鲜有报道。

间作在我国传统农业和现代农业中均发挥着重要作用,能维持农田生态系统稳定性,控制作物病害的发生,是国内外研究的热点[13]。小麦蚕豆(Vicia fabaL.)间作是许多国家和地区广泛采用的间作模式[14],具有增产、控病优势[15-16]。Luo 等[3]发现小麦蚕豆间作改变田间冠层小气候,降低了小麦白粉病的发生,同时,小麦和蚕豆种间互作调控小麦植株体内的氮含量及氮的累积、分配也是间作降低白粉病发生的机制之一[6,17]。显然,间作调控小麦植株氮含量、累积及分配,必然导致相关代谢物的差异。但是,现有的研究尚鲜从间作调控小麦代谢物的角度分析间作降低小麦白粉病发生的机制;此外,小麦差异代谢产物-氮水平-小麦白粉病的关系也并不清楚。因此本文通过盆栽试验,在小麦白粉病菌侵染的条件下,利用代谢组学分析不同氮水平下单作、间作小麦的差异代谢物,试图解析不同氮水平下间作调控小麦-白粉病菌互作提高小麦抗白粉病生理代谢机制,研究可为深入理解多样性种植降低小麦白粉病的发生提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 试验地点和供试材料

试验在云南农业大学植物营养系实验室内进行,光照时间为12 h,避光时间为12 h,光照强度3000 lx。试验期间温度保持在18～21 ℃,湿度55%～70%。盆栽试验供试土壤采自云南农业大学后山试验农场,为旱地红壤,土壤基本理化性状: 有机质26.46 g·kg-1,全氮1.89 g·kg-1,碱解氮92 g·kg-1,速效磷16 g·kg-1,速效 钾116 g·kg-1,pH 5.7。供试肥料为尿素(含N 46.0%)、普通过磷酸钙(含P2O516.0%)和硫酸钾(含K2O 50.0%)。

试验供试小麦品种为易感小麦白粉病的‘扬麦15’,由江苏省农业科学院提供;供试蚕豆品种为‘玉溪大粒豆’。试验所用的小麦白粉病菌为混合型白粉病菌,来自四川广泛流行的白粉病菌株,由四川省农业科学院提供;在恒温恒湿培养箱(温度18 ℃,湿度60%)中连续种植小麦,在小麦三叶期进行菌种扩繁,供后续接种使用。

1.2 试验设计与管理

试验设计为双因素设计,A 因素为种植模式: 小麦蚕豆间作(wheat-faba bean intercropping,IW),小麦单作(monocropped wheat,MW);B 因素为施氮水平:施氮量分别为75 mg·kg-1(N1)、150 mg·kg-1(N2)、225 mg·kg-1(N3)。共6 个处理,每个处理重复3 次。所有处理中,小麦和蚕豆的磷(P2O5) (过磷酸钙,含P2O516.0%)、钾(K2O)肥(硫酸钾,含K2O 50.0%)施用量均为100 mg·kg-1。

盆栽试验使用230 mm×130 mm 的塑料花盆。单作小麦每盆6 株,分2 行排列,行距10 cm,株距5 cm;小麦蚕豆间作中小麦、蚕豆各种1 行,行距10 cm,小麦株距5 cm,每盆3 株,蚕豆株距10 cm,每盆2 株。

盆栽试验开始前挑选颗粒饱满、大小均匀且无病虫害的小麦、蚕豆种子避光催芽3 d。试验前每盆称1.5 kg 干土,倒入各处理称好的肥料,拌匀后转入试验花盆中,之后将花盆随机摆放在培养架上;每两天浇一次水,每次每盆浇水200 mL。

1.3 病菌接种与病害调查

挑选恒温恒湿培养箱中前期培养的长势相同的感病小麦,取布满白粉病病斑的叶片中段5 cm,每3株试验小麦用一段感病叶片来摩擦接种。为保证分生孢子活性,剪一段接种一次,逐盆快速接种。

在白粉病接种的第3～10 天,根据《小麦白粉病测报调查规范》的8 级严重度分级标准[18],对小麦发生病害情况进行调查。根据病叶上病斑菌丝层覆盖叶片面积占叶片总面积的比率分为8 级,分别对应1%、5%、10%、20%、40%、60%、80%和100%。计算公式如下:

1.4 小麦样品采集

在小麦白粉菌接种72 h 时采集新鲜叶片,每个处理3 个生物学重复,采集的叶片混匀后装入冻存管中,立即存放在-80 ℃低温冰箱中冻存,用于进一步的广泛靶向代谢组测定。

1.5 样品提取与分离

先将小麦叶片放置于冻干机(Scientz-100F)中真空冷冻干燥;利用研磨仪(MM 400,Retsch)研磨(30 Hz,1.5 min)至粉末状;称取100 mg 的粉末,溶解于0.6 mL 70%甲醇提取液中;溶解后的小麦样品于4 ℃冰箱过夜,期间涡旋6 次,提高提取率;离心(转速10 000 g,10 min)后,吸取上清,用微孔滤膜(0.22 μm pore size)过滤样品,并保存于进样瓶中,用于UPLCMS/MS 分析。

数据采集仪器系统主要包括超高效液相色谱(Ultra Performance Liquid Chromatography,UPLC)(SHIMADZU Nexera X2,https://www.shimadzu.com.cn/)和串联质谱(Tandem mass spectrometry,MS/MS)(Applied Biosystems 4500 QTRAP,http://www.appliedbiosystems.com.cn/)。液相条件主要包括色谱柱: Agilent SB-C18 1.8 μm,2.1 mm×100 mm;流动相: A 相为超纯水(加入0.1%的甲酸),B 相为乙腈(加入0.1%的甲酸);洗脱梯度: 0.00 min B 相比例为5%,9.00 min内B 相比例线性增加到95%,并维持在95% 1 min,10.00～11.10 min,B 相比例降为5%,并以5%平衡至14 min;流速0.35 mL·min-1;柱温40 ℃;进样量4 μL。质谱条件主要包括电喷雾离子源(electrospray ionization,ESI)温度550 ℃,质谱电压5500 V (正模式)/-4500 V (负模式),帘气(curtain gas,CUR) 25 psi,碰撞诱导电离(collision-activated dissociation,CAD)参数设置为高。在三重四级杆(QQQ)中,每个离子对根据优化的去簇电压(declustering potential,DP)和碰撞能(collision energy,CE)进行扫描检测。

1.6 数据分析

使用SPSS 26.0 软件比较单间作小麦在不同氮水平下白粉病菌侵染情况,进行独立性T检验、两因素方差分析,使用Origin 2021、Excel 2016 进行数据处理、绘图。主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)用R 软件的内置统计pccomp 函数,设置pccomp 函数参数scale=Ture,表示对数据进行unit variance sacling (UV)归一化。OPLS-DA 在原始数据进行log2 转换后进行中心化处理,然后利用R软件中的MetaboAnalystR 包OPLSR.Anal 函数进行分析,继而进行建模分析。差异代谢物筛选标准: 选取差异倍数值(fold change)≥2 和fold change≤0.5 的代谢物。代谢物在对照组和试验组中差异为2 倍以上或0.5 以下,则认为差异显著。通过KEGG Pathway 得到差异代谢物中重要的代谢通路。利用KEGG 数据库对差异显著代谢物的注释结果进行分类和通路富集。

2 结果与分析

2.1 小麦蚕豆间作对小麦白粉病发病率和严重度的影响

在本试验条件下,小麦白粉病菌接种3 d 后出现发病症状。由表1 可知,白粉病发病率和病情指数主要受氮水平和氮水平×种植模式的影响。由图1可知,在发病初期(接种后3～4 d),单作、间作发病率和病情指数均无差异。随着侵染时间的延长,单间作模式下小麦白粉病在N1、N2、N3 水平的发病率和病情指数均表现为上升趋势。N1 水平下,在接种后的第5 天,间作显著降低了白粉病发病率38.81%;N2 水平下,在病原菌接种第6 天,间作显著降低发病率35.66%;N3 水平下,在病原菌接种后5～7 d,间作显著降低发病率25.54%。同样的,N1 和N2 水平下,在接种后第6～9 天,间作显著降低白粉病病情指数21.97%和21.17%;N3 水平下,在接种后第5～6 天,间作显著降低白粉病病情指数20.11%。综合来看,低氮水平下间作对白粉病的控制较好。

图1 与蚕豆间作和施氮水平对小麦白粉病发生的影响Fig.1 Effects of intercropping with faba bean and nitrogen application level on powdery mildew occurrence in wheat

表1 不同发病时期的氮水平、种植模式和氮水平×种植模式对小麦白粉病发病率和病情指数的影响Table 1 Effects of nitrogen level,planting pattern and nitrogen level × planting pattern on incidence and disease index of wheat powder mildew in different disease periods

2.2 单间作小麦差异代谢物的初步分析

PCA 是一种无监督模式识别的多维数据统计分析方法的多元统计分析,研究组间代谢物差异变化情况。对单作、间作小麦差异代谢物进行了主成分分析(图2),N1、N2 和N3 水平下,单作和间作小麦样品在主成分PC1 分离分别达44.42%、31.15%和41.57%,PC2 分别达22.29%、25.85%和 17.42%,PC1 和PC2 的模型分别解释了总方差的66.71%、57.00%和58.99%,结果表明氮水平和单作、间作两个处理之间明显分离,达到了相对满意的预测结果。

图2 不同施氮水平下单间作小麦叶片代谢物主成分分析Fig.2 Principal component analysis of leaves metabolites of mono-and inter-cropped wheat at different nitrogen application levels

2.3 单间作小麦差异代谢物的OPLS-DA 分析

OPLS-DA 是一种有监督的正交偏最小二乘判别分析方法,过滤了不相关的正交信号,所获得的差异代谢物更加可靠。R2X、R2Y分别表示所建模型对X和Y矩阵的解释率,Q2表示模型的预测能力[19]。对不同氮水平小麦单作、间作的叶片代谢物经OPLSDA 得分分析(图3A、B、C),可以看出氮水平和单作、间作存在得分差距,表明两个处理间的代谢产物存在差异。N1 模型的评价参数R2X、R2Y和Q2分别为0.655、0.992 和0.728,N2 分别为0.543、0.997和0.767,N3 分别为0.583、1 和0.846。其中,Q2＞0.5表示模型拟合有效。本模型对数据进行200 次随机排列组合试验(图3D、E、F),N1、N2 中Q2的P=0.11,N3 的P＜0.005;N1、N2 和N3 中 的R2Y均P＜0.005,表明本OPLS-DA 模型效果良好,可为后续的数据分析提供支持。

图3 不同施氮水平下单间作小麦叶片代谢物正交偏最小二乘法-判别分析得分图(A、B、C)与置换模型检验图(D、E、F)Fig.3 Orthogonal partial least squares method-discriminant analysis score maps (A,B,C) and displacement model test maps (D,E,F) of leaf metabolites in mono-and inter-cropped wheat at different nitrogen application levels

2.4 单间作小麦叶片差异代谢物筛选及分析

通过UPLC-MS/MS 检测,病菌侵染的小麦叶片共检测到822 种代谢产物(表2),分为11 大类: 黄酮、萜类、有机酸、生物碱、氨基酸及其衍生物、酚酸、木脂素和香豆素、脂质、核苷酸及其衍生物、鞣质以及其他类(维生素、糖及醇类等)。

表2 不同施氮水平下单间作小麦叶片差异代谢物分类Table 2 Classification of differential metabolites of leaves of mono-and inter-cropped wheat at different nitrogen application levels

从表2 可以看出,单作、间作小麦在低氮(N1)条件下共检测到69 种显著差异代谢物,其中上调的差异代谢物主要为生物碱(21 种)、氨基酸及其衍生物(14 种)、核苷酸及其衍生物(5 种)和有机酸(3 种)等,下调的差异代谢物主要为有机酸(5 种)、核苷酸及其衍生物(5 种)、酚酸(3 种)和脂质(2 种)等。正常施氮(N2)条件下共检测到52 种显著差异代谢物,其中上调的差异代谢物主要为黄酮(5 种)、生物碱(3 种)、氨基酸及其衍生物(1 种)等,下调的差异代谢物主要为核苷酸及其衍生物(15 种)、酚酸(7 种)、有机酸(5 种)和氨基酸及其衍生物(5 种)等。高氮(N3)条件下共检测到88 种显著差异代谢物,其中上调的差异代谢物主要为氨基酸及其衍生物(11 种)、生物碱(10 种)、有机酸(5 种)等,下调的差异代谢物主要为酚酸(21 种)、生物碱(10 种)、黄酮(9 种)等。

不同施氮量下的共同差异代谢物也不同。在韦恩图中(图4),N1 和N2 共同的差异代谢物有11 个,N2 和N3 共同的差异代谢物有9 个,N1 和N3 共同的差异代谢物高达26 个。而它们共同拥有的差异代谢物是核苷酸及其衍生物中的核糖腺苷,它分别在N1 和N3 水平中表达显著上调,而在N2 水平显著下调。单作、间作小麦的共同差异代谢物在N1和N3 水平中表现最多,在3 个氮水平下的共同差异代谢物只在N1 和N3 水平显著上调,因此推测单作、间作小麦在N1、N3 水平中共同的显著差异代谢物与病害发生相关。

图4 不同施氮水平下单间作小麦叶片差异代谢物Venn 图Fig.4 Venn diagram of differential metabolites in mono-and inter-cropped wheat leaves at different nitrogen application levels

2.5 差异代谢物KEGG 分类和富集分析

差异代谢物在相互作用的过程中形成了多种通路。基于白粉病侵染条件下,对单作、间作小麦叶片中不同氮水平所鉴定的通路注释并对结果分析,同时选取前20 种显著通路绘制KEGG 富集图。单作、间作小麦在低氮水平下,这些差异代谢物主要富集在代谢途径(31 个)、次生代谢的生物合成(17 个)和氨基酸的生物合成(15 个),其中代谢途径和氨基酸的生物合成显著富集(P＜0.05) (图5A)。在正常施氮水平下(图5B),差异代谢物主要富集在代谢途径(25 个)、次生代谢的生物合成(8 个)和嘌呤嘧啶(8 个),其中代谢途径显著富集(P＜0.05)。在高氮水平下(图5C),差异代谢物主要富集在代谢途径(34 个)、次生代谢物的生物合成(24 个)和氨基酸的生物合成(13 个),其中次生代谢物的生物合成和氨基酸的生物合成显著富集(P＜0.05)。本研究发现低氮和高氮两个水平在氨基酸的生物合成代谢通路都显著富集,推测此代谢通路与小麦白粉病的发生有关。

图5 单间作小麦在不同施氮水平的差异代谢物KEGG 分类和富集图Fig.5 KEGG classification and enrichment of differential metabolites in mono-and inter-cropped wheat at different nitrogen application levels

2.6 单间作小麦叶片差异代谢物层次聚类分析

对上调、下调差异倍数前10 的代谢物筛选出来并制作热图进行分析(图6)。其中间作在低氮条件下(图6A)上调了氨基酸及其衍生物(谷胱甘肽还原型、L-色氨酸、L-天冬酰胺和L-谷氨酰胺)、生物碱(N-阿魏酰五羟色胺、3-吲哚丙烯酸、甲氧基吲哚乙酸和3-吲哚乙腈)、有机酸(3-脲基丙酸)、黄酮(芹菜素-7,4′-二甲醚),下调了核苷酸及其衍生物(肌苷、8-羟基鸟苷和3′-腺嘌呤核苷酸)、有机酸(2-丙基苹果酸、2-异丙基苹果酸和3-异丙基苹果酸)、酚酸(香草乙酮和丁香醛)、氨基酸及其衍生物(L-鸟氨酸)、生物碱(薏苡素)。

图6 单间作小麦在不同施氮水平的差异代谢物的层次聚类图Fig.6 Hierarchical cluster diagrams of differential metabolites of mono-and inter-cropped wheat at different nitrogen application levels

间作在正常施氮条件(图6B)上调生物碱(2-羟基-7-甲氧基-1,4-苯并噁嗪-3(2H)-酮葡萄糖苷、对香豆酰基腐胺和吲哚)、黄酮[槲皮素-3-O-洋槐糖苷、槲皮素-3-O-(4′′-O-葡萄糖基)鼠李糖苷和槲皮素-3-O-芸香糖苷]、氨基酸及其衍生物(谷胱甘肽还原型)、萜类(海松酸)、脂质(3-羟基十八烷酸)、其他(芸香糖),下调了酚酸(阿魏酸、对甲氧基苯丙酸、肉桂酸、芥子酸和香草乙酮)、核苷酸及其衍生物(2′-脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷和胸苷)、生物碱(薏苡素)、木质素和香豆素(5,7,8-三羟基-6-甲氧基香豆素)。

间作在高氮条件(图6C)上调了氨基酸及其衍生物(L-天冬酰胺、L-高甲硫氨酸和L-色氨酸)、生物碱(3-吲哚乙腈、N-阿魏酰五羟色胺和甲氧基吲哚乙酸)、有机酸(3-脲基丙酸和十六烷基二酸)、酚酸(1-O-阿魏酰-3-O-对香豆酰甘油)、萜类(海松酸),下调了酚酸(对甲氧基苯丙酸、1-O-阿魏酰奎宁酸、3-O-阿魏酰奎宁酸、绿原酸、新绿原酸和5-O-阿魏酰奎尼酸)、生物碱(吲哚、对香豆酰基腐胺和N-葡萄糖基对香豆酰腐胺)、木质素和香豆素(东莨菪内酯-7-O-葡萄糖醛酸苷)。

3 讨论

本试验结果与前人研究结果[2]一致,小麦蚕豆间作可以显著降低小麦白粉病的发病率和病情指数,说明小麦蚕豆间作能够有效防治小麦白粉病。在田间条件下,小麦蚕豆间作降低了白粉病不同发病阶段的发病率,有效抑制了白粉病的侵染[11]。但是本试验条件下,由于人工接种，病原菌侵染压力较大,因此病害侵染初期(接种后0～5 d)和末期(接种后10 d)并未发现间作降低发病率和病情指数(图1)。

本试验条件在白粉病菌侵染下,单作、间作小麦叶片检测到多种差异代谢物,主要包括氨基酸及其衍生物、生物碱、黄酮、有机酸和酚酸等物质(表2)。本研究发现,虽然单作、间作小麦响应白粉病菌侵染的差异代谢物受氮水平调控,但是在低氮(N1)和高氮(N3)条件下,间作主要调控了氨基酸的生物合成。其中N1、N3 水平下,间作主要上调了谷胱甘肽还原型、L-色氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺和L-高甲硫氨酸等氨基酸及其衍生物,在N2 水平下,间作仅上调了谷胱甘肽还原型。谷胱甘肽是植物代谢组中的关键抗氧化剂之一,它还有利于将硒转化为还原硒,是与氨基酸结合的一种化学形式[20]。色氨酸在一定程度上具有对生物活性和抗病、虫害反应的作用[21]。而苯丙氨酸是苯丙烷生物合成的底物,在苯丙氨酸解氨酶的催化作用下经过特定的途径转化为具有苯丙烷骨架特征的次生代谢产物[22]。苯丙烷类化合物在植物受到病原菌侵染时,能够提高植物的抗性[23-24]。说明间作种植可能通过调节作物特定氨基酸的生物合成或代谢过程来提高作物自身抗性。

氨基酸是较容易受到环境压力影响的代谢物,它们参与多种代谢途径和许多次级代谢产物的结构,这些次级代谢产物参与防御、信号和结构过程[25]。因此氨基酸在植物抗病性中的作用受到广泛关注。小麦接种条纹花叶病毒后,叶片中苯丙氨酸减少,脯氨酸、精氨酸和异亮氨酸增加[26]。表明病原菌侵染植物后,氨基酸代谢会发生改变。本试验条件下,并未比较接种前后代谢产物的差异,因此尚不能确定单作、间作小麦在代谢产物方面响应病原菌侵染的差异。

本研究发现病原菌侵染后,作为次生代谢物的生物碱在低氮水平下间作显著上调了N-阿魏酰五羟色胺、3-吲哚乙腈、3-吲哚丙烯酸和甲氧基吲哚乙酸,但是随着施氮量的增加,生物碱上调和下调数量一致(表2),且在高氮条件下次生代谢物的生物合成也有显著富集,说明间作调控生物碱应答病原菌的侵染与施氮量密切相关。有研究表明,生物碱类物质具有一定抗菌活性作用[27-28]。本研究中五羟色胺的衍生物N-阿魏酰五羟色胺随着施氮量的增加也有不同差异倍数的变化,推测其与白粉病菌侵染有关。

黄酮类(芹菜素-7,4’-二甲醚)、黄酮醇(槲皮素-3-O-洋槐糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷和槲皮素-3-O-芸香糖苷)也均出现不同程度的上调。有研究表明黄酮类等代谢物质在植物体内也具有一定的抗菌、抗氧化等功能,对病原体的入侵具有一定的抵御效果,可以增强病原体的防御[29]。其中色氨酸、脯氨酸等氨基酸代谢的中间产物也参与了类黄酮、木质素等抗病相关物质的合成[30]。

其他的一些次生代谢物如萜类、酚酸类等物质对病原物也有直接抑菌的活性和信号传导的作用,能诱导植物表现抗病性从而阻止病原体入侵的作用[31-32]。高氮会减少马铃薯(Solanum tuberosumL.)叶片中绿原酸的浓度,降低马铃薯对病原菌的抗性[33]。高氮还会减少棉花(Gossypium hirsutumL.)叶片中萜类醛的分泌,从而受到病原菌侵染[34]。在低氮情况下,番荔枝[Annona emarginata(Schltdl.) H.Rainer]中与防御有关的挥发物质(如单萜和倍半萜)合成增加,使植物抗病性增强[35]。本试验中正常施氮和高氮下萜类(海松酸)均有不同程度上调,而酚酸类随着施氮水平的增加下调的数量不断增多,高氮水平下常见的酚酸如阿魏酸、绿原酸和新绿原酸均出现明显下调。由此推断在小麦白粉病发生侵染后诱导了相关抗病代谢产物的产生,帮助植物在防御途径中做出贡献。

4 结论

人工接种小麦白粉病菌条件下,小麦蚕豆间作主要降低了侵染后期(接种后5 d)白粉病的发病率和病情指数。病原菌侵染后,单作、间作小麦叶片差异代谢物受氮水平调控,其中氮胁迫条件下(N1和N3)差异代谢物均高于正常氮水平(N2)。与单作相比,间作小麦叶片黄酮、生物碱、氨基酸及其衍生物和酚酸等多种代谢产物发生改变。在氮胁迫下,N1 水平间作上调了谷胱甘肽还原型、L-色氨酸、L-天冬酰胺和L-谷氨酰胺,N3 水平间作上调了L-天冬酰胺、L-高甲硫氨酸和L-色氨酸。推测这些代谢产物,尤其是氨基酸及其衍生物可能参与调控抵御白粉病病菌的侵染。本研究利用代谢组学揭示了单作、间作小麦应答白粉病病菌侵染的生理代谢差异,为深入理解单作和间作小麦应对病害发生的代谢差异提供了理论依据和支撑。