APP下载

3种ELISA方法与微量细胞中和试验检测SARS-CoV-2抗体滴度的相关性分析

2023-06-28蒋国润赵恒廖芸范胜涛李丹丹张莹于丽王丽春李琦涵徐兴丽

中国生物制品学杂志 2023年6期
关键词:中和滴度抗原

蒋国润,赵恒,廖芸,范胜涛,李丹丹,张莹,于丽,王丽春,李琦涵,徐兴丽

中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室,云南 昆明 650118

新型冠状病毒肺炎(Coronavirus Disease 2019,COVID-19)是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARS-CoV-2)感染引起的可在人群中迅速传播的乙类传染病。截至2022 年2 月28 日,全球累计确诊COVID-19 4.34亿例,给国民经济造成巨大损失[1-3]。SARS-CoV-2感染后可引起无症状感染,发热、干咳或肌肉酸痛等普通型症状,重症患者还可出现呼吸困难、急性呼吸窘迫综合征、多器官功能衰竭甚至死亡[4-6],其中死亡病例约2.22%。因此应对SARS-CoV-2 感染进行预防及控制。

针对SARS-CoV-2 预防性疫苗的研究目前正在全球范围内开展[7-9],截至2022 年2 月28 日,全球累计有146 款疫苗正在进行临床试验,195 款疫苗处于临床前研究阶段(WHO官方发布)。目前针对SARSCoV-2 预防性疫苗的免疫原性评价主要以中和抗体或S 蛋白特异性IgG 为特征的体液免疫反应的激活状态来呈现[10-13]。其中,依赖活病毒开展的中和抗体检测方法需要在生物安全防护3 级实验室进行,检测周期相对较长,检测方法的实际应用受到较大限制。为利于SARS-CoV-2 特异性抗体的评价,我们在前期工作中已经建立了3 种直接ELISA 法,即抗S 蛋白特异性IgG 抗体(anti-S IgG)、抗N 蛋白特异性IgG抗体(anti-N IgG)和抗灭活全病毒颗粒特异性IgG 抗体(anti-virion IgG)检测方法[14]。

本研究同时采用以上3 种ELISA 检测方法和微量细胞中和试验,对前期在SARS-CoV-2灭活疫苗临床试验中获得的血清样品的抗体滴度进行检测,并对检测结果进行比较及相关性分析,以期为今后疫苗研发或临床中的抗SARS-CoV-2 特异性抗体筛选提供参考。

1 材料与方法

1.1 血清样品 为本所SARS-CoV-2灭活疫苗Ⅰ期临床试验血清样品,临床试验受理号为:NCT04412-538。该临床试验实验组共142例,分别采用0、14 d 2剂免疫(n=72)或0、28 d 2 剂免疫(n=70)接种程序。其中,0、14 d 2剂免疫组于2剂免疫后7、14和28 d分别采集血清样本,共216份;0、28 d 2剂免疫组于2剂免疫后7、28 d 分别采集血清样本,共140 份。为扩大样本量,将356 份血清样本全部纳入分析。本研究已获得四川大学华西第二医院伦理委员会批准,批准号为:Y2020008[15]。所有入选人员均签署书面知情同意书。

1.2 病毒、细胞及蛋白 SARS-CoV-2 由本所自主分离培养,命名为KMS-1,GenBank 登录号:MT2266-10.1,病毒滴度为6.37 lgCCID50/mL;Vero细胞购自美国细胞培养物收藏中心;SARS-CoV-2编码的S1蛋白购自三优生物医药上海有限公司;N 蛋白截短体由本所自主表达、纯化获得;灭活全病毒颗粒(灭活后SARS-CoV-2原液)由本所自主灭活、纯化获得。

1.3 主要试剂及仪器 羊抗人HRP-IgG 购自北京博思生物科技有限公司;酶标仪购自美国Biotex,SYNERGY 4。

1.4 检测方法

1.4.1 3 种ELISA 检测方法 用SARS-CoV-2 编码的S1蛋白(包被浓度1 μg/mL)、N蛋白截短体(包被浓度1 μg/mL)及灭活全病毒颗粒(包被浓度2 μg/mL)分别包被酶标板,包被液为0.01 mol/L PBS。使用前将酶标板室温平衡30 min;用稀释液将血清以1∶400 开始进行2 倍系列稀释后,加至S、N 和全病毒颗粒抗体检测板中,100 μL/孔,同时设2 孔阴性血清对照(健康人血清,1∶400 稀释)和1 孔空白对照;置37 ℃孵育1 h;洗板5 次,拍干,加入羊抗人HRP-IgG(1∶10 000稀释),100 μL/孔,置37 ℃孵育0.5 h;洗板5 次,拍干,加入单组份TMB 显色液,100 μL/孔,室温避光显色10 min;加入2 mol/L H2SO4,终止反应。上酶标仪,以450 nm 为吸收波长,630 nm 为参比波长,读取各孔吸光度值。以2.1 倍阴性对照平均A值为Cutoff 值,当样品A值≥Cutoff 值时记为阳性,每个血清样品阳性终点对应的稀释倍数即为该血清样品中S、N或总抗体的抗体效价。

1.4.2 微量细胞中和试验 取60 μL 血清,置56 ℃水浴灭活处理30 min;将KMS-1 进行10 倍系列稀释至100 CCID50/0.05 mL 备用。在带盖、无菌96 孔平底细胞培养板中将灭活后的血清(25 μL)以1∶4 开始进行倍比稀释,每份血清、每个稀释度同时平行接种2 孔,稀释完成后均加入含100 CCID50的病毒稀释液,0.05 mL/孔,置37 ℃,5%CO2培养箱中和2 h,中间振荡1 次;加入Vero 细胞悬液,20 000 个/孔,置37 ℃,5% CO2培养箱静置培养,同时设正常细胞对照。病毒接种后第2天显微镜下观察细胞生长情况,第4 天观察细胞病变情况,第7 天判定结果。Karber法计算中和终点(将血清稀释度转化为对数),即能保护50%细胞不受100 CCID50攻击病毒感染的血清最高稀释度为该血清的抗体滴度。待检样本中和抗体结果≥1∶4 判为阳性,<1∶4 判为阴性。

1.5 统计学分析 利用SPSS 24.0 软件将3 种ELISA法检测所得抗体滴度(对数转换)分别与中和抗体检测法所得抗体滴度(对数转换)进行双变量-Pearson相关性分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 受试者血清抗体阳性例数比较 4种方法对356份血清的检测结果显示,中和抗体阳性血清为300份,阳转率为84.3%(300/356),anti-S IgG与其最接近,阳性血清为325份,阳转率为91.3%(325/356),anti-N IgG阳性血清为232例,阳转率为65.2%(232/356),anti-virion IgG 阳性血清为166 份,阳转率为46.6%(166/356)。表明以S 蛋白作为抗原检测所得IgG阳转率与中和抗体最接近,而以N 蛋白和灭活全病毒颗粒为抗原检测所得IgG 阳转率明显低于中和抗体。

2.2 受试者血清抗体滴度比较 4 种方法检测结果显示,中和抗体几何平均滴度为16.6;anti-S IgG 抗体几何平均滴度为945.9;anti-N IgG抗体几何平均滴度为72.7;anti-virion IgG 抗体几何平均滴度为18.8。表明以S 蛋白作为抗原检测所得IgG 抗体滴度与中和抗体滴度变化趋势最接近,而以N 蛋白和灭活全病毒颗粒作为抗原检测所得IgG 抗体滴度与中和抗体滴度存在差异,后两者IgG抗体几何平均滴度甚至处于阳性阈值以下(400),不适用于表征中和抗体滴度。

2.3 4 种方法检测受试者血清抗体滴度的相关性分析 将3 种ELISA 方法检测所得IgG 抗体滴度(对数转换)与中和抗体滴度(对数转换)分别进行相关性分析,结果显示,2 剂免疫后血清anti-S IgG 抗体平滴度与中和抗体滴度相关性最强[相关系数(r)=0.494,P<0.001),anti-N IgG 抗体滴度次之(r=0.371,P<0.001),而anti-virion IgG最差(r=0.181,P=0.001),见图1。表明anti-S IgG 抗体滴度与中和抗体滴度相关性最强,因此其在很大程度上可反映中和抗体的变化情况。

图1 4种检测方法所得血清抗体滴度的相关性分析Fig.1 Correlation analysis among serum antibody titers detected by four detection assays

3 讨论

在SARS-CoV-2 特异性抗体的评价中,基于活病毒的微量细胞中和试验一直是检测金标准,但该方法需在生物安全3级实验室中进行,一般实验室难以开展。因此通过比较现有实验方法,寻找与其一致性较好,且操作简单、快速、重复性好,在常规实验室即可完成的实验方法具有较大的实际应用价值。

ELISA作为常用抗体检测方法一直应用广泛[16-20]。在本实验前期工作中,基于SARS-CoV-2 的结构特征设计了S 蛋白、N 蛋白和灭活全病毒颗粒3 种抗原,并建立了相应的ELISA 方法。S 蛋白分布于病毒颗粒表面,病毒可通过S蛋白上的受体结合域(receptorbinding domain,RBD)与人体上皮细胞的血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)结合,以介导病毒进入细胞的感染过程[21-22]。因此,S蛋白一直被认为是SARS-CoV-2 的主要决定抗原,且S 蛋白还是中和抗体的靶标蛋白[23-24]。N 蛋白作为SARS-CoV-2 病毒颗粒中表达量最高的蛋白,对N 蛋白特异性免疫反应的评价也越来越受到重视[25]。灭活全病毒抗原由于包含全部的病毒抗原,理论上是检测血清抗体的理想靶标。本研究分别采用检测anti-S IgG、anti-N IgG、anti-virion IgG 以及中和抗体的4 种方法,对疫苗免疫后356 份血清进行了分析,结果显示,在定性结果中,anti-S IgG与中和抗体检测结果趋于一致但略高于中和抗体,但结合抗体滴度定量和相关性分析结果,anti-N IgG 和anti-virion IgG 抗体几何平均滴度则与中和抗体存在显著差异,甚至为阴性值,同时,以上2 种抗体滴度与中和抗体滴度相关性也较差。因此,以S蛋白作为抗原的ELISA检测法最适于SARS-CoV-2抗体检测。

用4种方法检测阳性血清例数,以S蛋白作为抗原的ELISA 方法检测的阳性率略高于微量细胞中和试验。针对本所自主建立的以S蛋白作为抗原的ELISA方法,在方法建立之初即完成了专属性、精密度及相对准确性的验证。专属性结果显示,该试剂盒能特异性检测出SARS-CoV-2 S 抗体和SARS-CoV-2 阳性血清参比品,其他病毒疫苗免疫血清及类风湿阳性血清无交叉反应;精密度的几何变异系数小于15%;方法符合《中国药典》三部(2020 版)技术指南9401“生物制品活性/效价测定方法验证指导原则”,可用于SARS-CoV-2 S抗体检测。从方法学上来说,本试剂盒可用于检测SARS-CoV-2 S 抗体,但阳转率高于微量细胞中和试验这一结果尚需进行深入研究。

综上所述,本研究建立的以S 蛋白作为抗原检测IgG 的ELISA 方法与微量细胞中和试验中和抗体检测结果相关性较好,但存在一定误差,今后更大规模人群及真实世界的检测实验中,应进一步探索两种方法间的对应关系,并提高两者相关性。

猜你喜欢

中和滴度抗原
不同富集培养方法对噬菌体PEf771的滴度影响
免疫塞内卡病毒灭活疫苗后豚鼠、家兔与猪的血清中和抗体相关性研究
重组腺相关病毒基因药物三种滴度的比较与分析
自身免疫性肝病诊断中抗核抗体与自身免疫性肝病相关抗体检测的应用价值
范扬:博采与中和的风范
在幽深与高古中追寻中和之美——读段朝林中国画作品有感
梅毒螺旋体TpN17抗原的表达及纯化
结核分枝杆菌抗原Lppx和MT0322人T细胞抗原表位的多态性研究
APOBEC-3F和APOBEC-3G与乙肝核心抗原的相互作用研究
慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA,HBeAg和ALT滴度与恩替卡韦疗效的关系