人用狂犬病疫苗（Vero细胞）宿主残余DNA qPCR检测方法的建立及验证

刘利强，包小华，周慧明，曾智，刘建华，张海平，迟宝琦，汪树生，刘大维

1.吉林农业大学，吉林 长春 130118；2.中国人民解放军联勤保障部队第964医院，吉林 长春 130000；3.吉林惠康生物药业有限公司，吉林 长春 130000；4.长春百克生物科技股份公司，吉林 长春 130012

狂犬病是由狂犬病病毒引起的一种侵害中枢神经系统的急性病毒性传染病［1］。目前对于狂犬病尚缺乏有效的治疗手段，人患狂犬病后的病死率近100%，及时进行狂犬病疫苗的接种是预防、控制和消灭狂犬病的唯一方法［2］。

目前已在中国境内生产上市的人用狂犬病疫苗使用的细胞基质主要为Vero 细胞系［3-4］，其生产工艺为细胞接种、培养，病毒接种、培养、洗换、收获，病毒纯化、灭活，制备原液。宿主细胞残余DNA 已被文献记载有致瘤性及外源因子传播的风险，而该工艺无法完全去除宿主细胞残余DNA［4］；美国FDA 认为宿主细胞残余DNA 片段长度不大于200 bp，可有效控制风险［4-5］。因此，在生产过程中必须对宿主细胞残余DNA 进行严格的质量控制，以确保生物制品的安全性和有效性［6-8］。

在《中国药典》三部（2015版）冻干人用狂犬病疫苗（Vero 细胞）仅要求成品中Vero 细胞残余DNA 应不高于100 pg／剂（通则3407第一法），而《中国药典》三部（2020版）冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞）要求原液中Vero 细胞残余DNA 检测采用qPCR 法（通则3407 第三法），应不高于3 ng／剂［9］。可见随着科学发展和技术进步，宿主细胞残余DNA 的检测方法更灵敏、更准确，质量控制更严格。

《中国药典》三部（2020版）通则3407外源性DNA残留量测定法中提供了3 种残余DNA 的检测方法，即第一法DNA 探针杂交法、第二法荧光染色法、第三法qPCR 法。DNA 探针交杂法和荧光染色法在自身技术上均存在局限性：DNA探针杂交法耗时长，灵敏度较低且不能完全定量；荧光染色法灵敏度较低，易受其他DNA 序列的干扰［10-12］。而qPCR 法为《中国药典》三部（2020版）首次收录的新方法，与其他方法相比，qPCR 法具有简单、快速、更加灵敏、能检测含量较低的残余DNA 及定性分析残余DNA 相对分子质量大小和分布等优点［13-17］。《中国药典》三部（2020版）冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞）要求原液中Vero细胞残余DNA 采用qPCR 法（通则3407第三法）进行检测［9］，但由于药典内容非常精炼、简明，对于该方法的验证和评估较为宽泛且缺乏实际数据实例。本研究依据药典和产品特性建立了更科学、更系统检测人用狂犬病疫苗（Vero细胞）宿主残余DNA的qPCR法，并进行了验证，评估专属性、准确度、重复性、中间精密度、定量限度、线性范围及耐用性，最终建立了人用狂犬病疫苗（Vero 细胞）宿主残余DNA 绝对定量的质量控制方法。

1 材料与方法

1.1 标准品及供试品 Vero细胞DNA定量国家标准品（限qPCR法），批号：250021-201901，由中国食品药品检定研究院提供；人用狂犬病疫苗（Vero 细胞）原液，批号：SB202108019、SB202110024、SB202111025、SB202111026，由吉林惠康生物药业有限公司提供。

1.2 主要试剂及仪器 Vero 残余DNA-154 检测试剂盒、Vero 残余DNA 片段分析检测试剂盒和宿主细胞残余DNA 样本前处理试剂盒购自湖州申科生物技术有限公司；7500型qPCR仪购自赛默飞世尔（上海）仪器有限公司。

1.3 标准品配制 用Vero残余DNA-154检测试剂盒中提供的DNA 稀释液将Vero 细胞DNA 定量国家标准品（107 ng／μL）进行梯度稀释，使其终浓度分别为30、3、0.3、0.03、0.003和0.000 3 ng／mL，编号分别为：ST2 ～7。另取试剂盒中DNA 稀释液作为阴性对照。

1.4 样品配制 按照宿主细胞残余DNA样本前处理试剂盒说明书进行操作。采用磁珠法提取供试品中残余DNA，加至离心管中，经蛋白酶K消化液55 ℃消化处理1 h后，进行离心、洗涤和洗脱等步骤的处理。阴性对照样品和供试品加标组样品处理方法同此。

1.5 样品检测 按照Vero残余DNA-154检测试剂盒使用说明书进行操作。反应体系为：Vero Primer &Probe MIX-154试剂3 μL，qPCR Reaction Buffer 17 μL，DNA 供试品或标准品曲线样品等模板10 μL，总体积30 μL。轻微振荡混匀后，短时间快速离心10 s，放入qPCR仪中。PCR反应条件为：95 ℃预变性10 min；进行两步法PCR，95 ℃变性15 s，60 ℃退火和延伸1 min，共40个循环。

1.6 数据计算 qPCR 程序运行结束后，设置阈值为0.02，在该条件下用标准品的循环阈值（cycle threshold，Ct）对DNA 浓度绘制标准曲线，将待测样品的Ct值代入方程，计算其初始浓度。

1.7 方法验证

1.7.1 线性范围 取6个浓度（30、3、0.3、0.03、0.003和0.000 3 ng／mL）Vero 细胞DNA 定量国家标准品进行检测，每个浓度重复3 次，得出标准曲线的相关系数（R2）和斜率。

1.7.2 定量限 取3 pg／mL Vero 细胞DNA 定量国家标准品进行检测，重复6 次，计算回收率和相对标准偏差（RSD）。

1.7.3 专属性 取Vero细胞DNA定量国家标准品，按1.3项方法进行梯度稀释后，绘制标准曲线。取SB2-02108019 批人用狂犬病疫苗（Vero 细胞）原液、含人血白蛋白的PBS溶液、Tris缓冲液、MgCl2溶液（用PBS稀释），按照1.4项方法提取DNA，进行qPCR检测。

1.7.4 重复性 取SB202108019 批人用狂犬病疫苗（Vero 细胞）原液为供试品组，按照1.4 项方法提取DNA，进行qPCR检测，重复检测6次，计算RSD。

1.7.5 中间精密度 取SB202108019 批人用狂犬病疫苗（Vero 细胞）原液为供试品组。由同一实验人员在不同时间分别对该批供试品进行样品处理和检测，每份样品平行测定3次。由3名实验人员于相同时间分别对该批供试品进行样品处理和检测，每份样品平行测定3 次。按照1.6 项方法计算供试品不同人员、不同时间检测值的RSD。

1.7.6 准确度 取SB202108019 批人用狂犬病疫苗（Vero 细胞）原液，按9∶1加入DNA 稀释液作为供试品，取同批人用狂犬病疫苗（Vero细胞）原液，按9∶1加入浓度为200、20、3.3 ng／mL的Vero细胞DNA定量国家标准品，使标准品终浓度为20、2、0.33 ng／mL，每份样品制备3份，作为供试品加标组。按照1.4项方法提取DNA，进行qPCR 检测，每份样品平行测定3次，按下式计算回收率，并计算RSD。

1.7.7 耐用性 取SB202108019 批人用狂犬病疫苗（Vero 细胞）原液为供试品组。按照1.4 项方法提取DNA，样品处理时蛋白酶K消化温度调整为53、55和57 ℃，其余实验条件不变。样品处理完成后，进行qPCR检测，计算不同温度下供试品残余DNA含量的RSD。

1.8 方法的初步应用 取SB202110024、SB202111025、SB202111026 批人用狂犬病疫苗（Vero 细胞）原液，按照1.4项方法提取DNA，进行qPCR 检测；取SB20-2110024、SB202111025、SB202111026 批人用狂犬病疫苗（Vero 细胞）原液，按照Vero 残余DNA 片段分析检测试剂盒说明书进行DNA片段大小定性分析。

1.9 统计学分析 使用Minitab 21软件对3批原液的Vero 细胞DNA 残留量检测数据进行正态性检验和单值控制图统计分析，P≥0.05 为数据结果符合正态分布，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 方法的验证

2.1.1 线性范围 Vero 细胞DNA 定量国家标准品浓度在0.000 3 ～30 ng／mL范围内线性成立，3次检测R2分别为0.995、0.996、0.998，均大于0.99，斜率分别为-3.58、-3.55、-3.58，均在-3.1 ～-3.8范围内。见表1、图1和图2。确定DNA检测范围为0.3 pg／mL ～30 ng／mL。

图1 线性范围确立的qPCR扩增曲线Fig.1 qPCR amplification curves for determination of linear range

图2 线性范围确立的标准曲线Fig.2 Standard curves for determination of linear range

表1 标准品线性范围确立的qPCR检测结果Tab.1 qPCR results for determination of linear range of standard samples

2.1.2 定量限 3 pg／mL Vero细胞DNA定量国家标准品残余DNA 含量6 次检测结果分别为3.68、3.59、3.32、2.76、3.32、3.49 pg／mL，平均值为3.36 pg／mL；RSD为9.739%，小于10%；回收率分别为123%、120%、111%、92%、111%、116%，在90%～125%范围内。确定方法定量限为3 pg／mL。

2.1.3 专属性 可检出人用狂犬病疫苗（Vero 细胞）原液中残余DNA含量，而含人血白蛋白的PBS溶液、Tris缓冲液、MgCl2溶液检测的Ct值分别为37.941 2、33.479 9、35.089 4，均大于标准曲线最低点的平均Ct值（29.442 9）。表明人用狂犬病疫苗（Vero 细胞）原液中其他成分对残余DNA 含量的检测无干扰，专属性良好。

2.1.4 重复性 狂犬病疫苗（Vero细胞）原液残余DNA含量6次检测结果分别为0.636、0.652、0.689、0.600、0.676、0.636 ng／mL，平均值为0.648 ng／mL，RSD为4.92%。表明重复性良好。

2.1.5 中间精密度 同一实验人员不同时间对同一供试品独立检测3 次的残余DNA 含量在0.565 ～0.689 ng／mL范围内，日内RSD为1.180%～4.125%，日间RSD为6.394%。3名实验人员同一时间对同一供试品各独立检测3 次的残余DNA含量在0.571 ～0.769ng／mL范围内，同一人员RSD为1.180%～7.156%，不同人员间RSD为9.721%。RSD均小于10%，可满足Vero细胞残余DNA的检测要求。见表2和表3。

表2 同一实验人员不同时间检测的中间精密度验证结果Tab.2 Intermediate precision verification results at different times by the same experimenter

表3 不同实验人员相同时间检测的中间精密度验证结果Tab.3 Intermediate precision verification results by different experimenters at the same time

2.1.6 准确度 供试品加标回收率为95% ～119%，均在90% ～120%范围内，RSD为0.855% ～2.76%，均小于3%。见表4。

表4 准确度验证Tab.4 Verification for accuracy

2.1.7 耐用性 蛋白酶K消化温度为53、55和57 ℃时，qPCR检测结果分别为0.604、0.565和0.548 ng／mL，RSD为5%。表明该方法耐用性良好。

2.2 方法的初步应用 标准品和供试品扩增曲线光滑平稳，平行性良好，均呈现典型的2n式指数扩增，符合定量检测要求，见图3。SB202110024、SB2021-11025、SB202111026批原液Vero细胞残余DNA 含量分别为0.77、0.20、0.45 ng／剂，符合《中国药典》三部（2020版）要求。宿主残余DNA ＞154 bp的片段占52%～63%，见表5。

图3 SB202110024（A）、SB202111025（B）、SB202111026（C）批人用狂犬病疫苗（Vero 细胞）原液细胞残余DNA 检测的扩增曲线Fig.3 Amplification curves of residual DNA in cells of SB202110024（A），SB202111025（B）and SB202111026（C）batches of human rabies vaccine（Vero cells）stock solution

表5 3 批人用狂犬病疫苗（Vero 细胞）原液中DNA 片段大小分布情况（%）Tab.5 Size distribution of DNA fragments in three batches of human rabies vaccine（Vero cells）stock solution（%）

2.3 统计学分析P值为0.604，大于0.05，差异无统计学意义，数据结果符合正态分布，所有数值均在3倍标准偏差范围内，波动不明显。见图4和图5。

图4 DNA残留量概率图Fig.4 Probability plot of DNA residues

图5 DNA残留量的单值控制图Fig.5 Individual control chart of DNA residues

3 讨论

目前，Vero 细胞是人用病毒性疫苗的主要生产基质，加强Vero细胞的质量控制，是确保疫苗安全性的重要前提［18-19］。其中Vero细胞残余DNA具有致瘤性、外源因子传播和致畸性等安全风险，为保证产品质量，确保患者用药安全，疫苗生产企业应确认生产过程中残余DNA的去除水平［4，20-21］。

qPCR是一种快速、高通量进行DNA定量检测的方法，具有特异性强、灵敏度高、准确度好、周期短、通量高等优势，较适合残余DNA含量的检测［4，22］。

本研究采用qPCR 法对人用狂犬病疫苗（Vero细胞）中宿主残余DNA 质量控制方法进行了验证，结果显示，方法的线性、定量限、专属性、准确度、重复性、中间精密度及耐用性均可达到方法验证的要求，可用于本研究人用狂犬病疫苗（Vero 细胞）原液残余DNA绝对定量检测的质量控制要求。中间精密度验证中，不同人员之间的检测值RSD大于同一人员不同时间检测值的RSD，表明检测与人员操作存在一定相关性，需日常监测并分析不同人员间的操作差异，通过操作培训可适当降低人为因素的影响。

使用本研究建立的方法对3 批人用狂犬病疫苗（Vero 细胞）原液残余DNA 含量进行检测，结果均远低于3 ng／剂，符合《中国药典》三部（2020 版）中规定的要求；＞221 bp 的DNA 片段占总DNA 残留量的比例均未超过25%，DNA 片段分布的中位数所在区间小于221 bp。使用统计学软件进行分析，检测数据呈正态分布（P＞0.05），表明qPCR 法为绝对定量检测，相比于DNA 探针杂交法，检测结果的准确度更高，通过对结果的趋势分析，更有利于产品质量的有效控制。

qPCR 法适用于本研究中人用狂犬病疫苗（Vero细胞）原液残余DNA绝对定量分析，与传统的DNA探针杂交法相比，qPCR 法既能精确定量残余DNA 水平，也能定性检测出DNA片段的大小分布。《中国药典》三部（2020版）中仅对残余DNA含量制定了标准，未对残余DNA 片段大小制定标准。因此，本研究对人用狂犬病疫苗（Vero 细胞）生产过程和最终产品残余DNA含量检测和控制具有重要意义。