马铃薯黑痣病菌拮抗细菌的筛选及鉴定

2023-06-27王鹏李雯王悦武志鑫台莲梅靳学慧

黑龙江八一农垦大学学报 2023年3期

王鹏，李雯，王悦，武志鑫，台莲梅，靳学慧，2

（1.黑龙江八一农垦大学/黑龙江省作物有害生物互作生物学及生态防控重点实验室，大庆 163319；2.黑龙江省植物抗性研究中心）

马铃薯（Solanum tuberosumL.）种植面积广，适应性强，营养价值高，能够满足人体营养需求，深受人们喜爱。随着马铃薯产业快速发展，出现倒茬困难和连作障碍问题，这使马铃薯土传病害日益加重[1]。由立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）引起的马铃薯黑痣病是马铃薯主要的土传病害，也是世界性土传真菌病害[2]。病原菌寄主范围广泛，已知可侵染200 多种植物[3]。病菌以菌丝体或菌核在马铃薯块茎、病残体或土壤中越冬，主要危害马铃薯根茎、匍匐茎和薯块，发生严重时可影响马铃薯出苗率和产量[4]。在国内每年多省份均有不同程度发生，重病田病株率高达80%以上，病害制约着马铃薯产业的发展[5]。长期以来，防治马铃薯黑痣病主要依靠化学药剂，而化学药剂的长期使用会影响土壤质量、农作物生产力、药剂残留等问题[6]。因此，需要寻找对环境、人类以及作物本身更安全的方法，利用微生物防治土传病害具有对环境安全、投入低、资源充足等特点，是解决这些问题的有效途径[7]。

目前，国内外已有不少学者对生防菌防治土传病害进行研究，使用生防微生物防治马铃薯黑痣病已经成为当下热点。Hussain 等[8]发现哈茨木霉（Trichoderma harzianum）可以产生蛋白酶，能够降解病原体细胞壁，降低病原体生长或感染植物的能力，减轻马铃薯黑痣病的发生。王天君等[9]从17 株木霉菌中筛选得到一株拟康宁木霉（Trichoderma pseudokoningii）78 无菌发酵液对立枯丝核菌的抑制率为92.90%，利用木霉菌剂处理薯块，显著降低马铃薯黑痣病的病情指数，盆栽试验防效达59.07%～70.11%。芽孢杆菌因其能形成芽孢，对外界抵抗能力强，并且分布广，在植物病害防治上具有巨大潜力，因此成为研发微生物杀菌剂的重要资源。关小敏等[10]从甘肃省连作马铃薯田分离得到一株类芽孢杆菌（Paenibacillus jamilae）G1 对马铃薯黑痣病菌有较强的拮抗效果。朱明明等[11]从河北省和内蒙古马铃薯根际土中分离得到141 株芽孢杆菌，其中贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）HN-Q-8 发酵液对马铃薯黑痣病防效最强，该菌株在15 ℃以上就可以对病原菌起到抑制作用。许丽婷等[12]从马铃薯根际土壤分离筛选得到一株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）XC-1 并分析了该菌株的生防特性，该菌株可以产纤维素酶、蛋白酶抑制病原菌的生长，小区试验，XC-1 对马铃薯黑痣病的防效达54.51%，增产22.02%。而黑龙江省此方面的研究报道较少，另外，地域不同，同种微生物所处环境条件不同，其防治效果和机理也不同[13-14]。

因此，从马铃薯黑痣病发病的连作田取样，通过平板对峙培养筛选获得对黑痣病菌有较好的拮抗菌株，进一步盆栽试验确定其防效，鉴定其分类地位，为防治马铃薯黑痣病的生物菌剂研发提供菌种资源和理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试品种

供试品种：延薯4 号（原种2 代），由讷河市鑫丰种业有限公司提供。

1.2 供试病原菌

病原真菌：立枯丝核菌由黑龙江八一农垦大学病理实验室保存。

1.3 供试培养基

LB、NA、PDA、PDB 培养基参照《植病研究法》进行配置[15]。

1.4 试验方法

1.4.1 细菌的分离和纯化

采用土壤稀释法分离细菌（土样采集自黑龙江省克山农场马铃薯黑痣病发病地块根际土），吸取100 μL 土壤悬浮液涂布到LB 平板上，28 ℃培养2 d。挑选不同菌落形态、颜色和大小，平板划线纯化培养后编号保存。

1.4.2 拮抗细菌的筛选及病原菌菌丝形态观察

首先进行拮抗细菌初筛，PDA 培养基中心接种5 mm 活化好的黑痣病菌，十字交叉法接种待测菌株。每处理3 次重复，28 ℃培养3 d，将对黑痣病菌有抑菌圈的细菌菌株进一步复筛。

复筛采用平板对峙法。将初筛获得的菌株划线活化，取单菌落接种于LB 培养液中，30 ℃、180 r·min-1培养2 d，将菌液调至OD600=0.8 备用。PDA 培养基中心接种5 mm 黑痣病菌，十字交叉法接种待测菌株菌液5 μL，接无菌水为对照，每处理3 次重复，28 ℃培养3 d。将抑制效果最好的拮抗菌株保存备用。同时，利用显微镜观察拮抗效果最好的菌株在峙平板上对马铃薯黑痣病菌菌丝的影响。

抑菌率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100%。

1.4.3 拮抗细菌分泌胞外酶测定

拮抗菌株分泌纤维素酶的测定参考穆春雷[16]的方法；拮抗菌株分泌蛋白酶的测定参考尹春筱[17]的方法；拮抗菌株分泌葡聚糖酶的测定参考赵军岗[18]的方法。

1.4.4 拮抗菌株对马铃薯黑痣病盆栽防效的测定

在室外条件下采用桶栽接种测定菌株对马铃薯黑痣病的防治效果。选取大小一致健康马铃薯种薯，切成大小相近的薯块备用。将活化好的立枯丝核菌10 个菌饼（5 mm）接种至PDB 培养液中，28 ℃、120 r·min-1培养7 d，利用豆浆机将菌落打散，调节浓度为1×103cfu·mL-1备用。将拮抗菌株单菌落接种于LB 培养液中，30 ℃、180 r·min-1培养2 d，调节拮抗菌浓度为1×108cfu·mL-1备用。用口径20 cm、深25 cm的桶种植马铃薯，每桶装土15 kg，将150 mL 立枯丝核菌菌悬液和土壤充分混合配成带菌土。

试验设计如下，处理1：每桶加入240 mL 无菌水为空白对照；处理2：每桶加入240 mL 无菌LB 培养液；处理3：每桶加入240 mL 的拮抗菌株发酵培养液。每桶种植3 块马铃薯薯块，每个处理5 桶，3 次重复。每桶播种出苗60 d 后调查发病情况，同时测量株高、茎粗、侧根长、侧根数、匍匐茎数，并计算防效。

马铃薯黑痣病病害分级标准参照Weinhold[19]地下茎分级标准。

发病率=发病株数/调查总株数×100%

病情指数=Σ（发病株数×发病级别/调查总株数×最高发病级别）×100

防治效果=（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数×100%。

1.4.5 拮抗菌株的鉴定

将拮抗菌株划线接种至NA 平板上，30 ℃培养24 h 后观察菌落形态，并参照东秀珠和刘波等[20-21]描述进行生理生化特征鉴定。

采用北京天根生化科技有限公司的试剂盒提取菌体DNA；参考陈志垚等[22]扩增16S rRNA 基因，PCR 产物送至北京六合华大基因科技有限公司进行测定。

1.5 数据统计与分析

采用Excel 2016 进行数据统计，利用SPSS 22.0软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌株的分离筛选及病原菌菌丝形态观察

从马铃薯根际土样中分离得到303 株细菌，最终筛选出一株细菌菌株对立枯丝核菌抑制效果最好，抑制率达78.91%（图1B），将其编号为KSD17。显微镜观察，CK 对照菌丝表面光滑、匀称，内容物均匀（图1C）；菌株KSD17 处理过的菌丝膨大、弯曲、表面干瘪、皱缩，内容物不均匀（图1D）。

图1 菌株KSD17 对立枯丝核菌的抑制效果Fig.1 Inhibitory effect of strain KSD17 on Rhizoctonia solani

2.2 拮抗菌株KSD17 胞外酶测定

对菌株KSD17 产纤维素酶、蛋白酶及β-1，3-葡聚糖的能力进行测定（图2）。菌株KSD17 在羧甲基纤维素酶鉴别培养基和蛋白酶鉴别培养基中产生明显的水解圈（图2A，B），在β-1，3-葡聚糖检测培养基中产生较小的水解圈（图2C）。说明该菌株具有产羧甲基纤维素酶、蛋白酶能力以及β-1，3-葡聚糖的能力。

图2 菌株KSD17 在鉴定培养基上的透明圈Fig.2 The transparent circle of strain KSD17 on the identification medium

2.3 拮抗菌株KSD17 对马铃薯黑痣病的盆栽防效

采用盆栽试验进行了菌株KSD17 对马铃薯黑痣病的防效试验。结果表明，CK 空白对照和LB 培养液对照处理的马铃薯地下茎发病重，发病率分别为98.33%、95.00%，病情指数分别为59.11、64.00，处理间差异不显著，但显著高于菌株KSD17 发酵液处理的病情指数（P＜0.05）（表1）。CK 空白对照和LB 培养液处理马铃薯植株茎部出现大面积褐色病斑，病害程度比较严重（图3）。 KSD17 发酵液处理黑痣病发病率为56.67%，病情指数20.00，菌株KSD17 对黑痣病的防效为66.17%。说明菌株KSD17 对马铃薯黑痣病有较好的防治效果。

表1 菌株KSD17 对马铃薯黑痣病的盆栽防效Table 1 Determination of potted control effect of strain KSD17 against potato black scurf

图3 菌株KSD17 的盆栽防效Fig.3 Determination of potted control effect of strain KSD17

2.4 拮抗菌株KSD17 对马铃薯植株生长的影响

拮抗细菌对马铃薯形态指标的影响，LB 培养液和CK 空白对照对马铃薯植株形态指标差异不显著（P＜0.05）（表2）。但菌株KSD17 处理的株高和匍匐茎较CK 差异显著，分别增加了9.05%和22.04%。试验结果表明，菌株KSD17 对马铃薯的生长具有促生作用。

表2 菌株KSD17 对马铃薯形态指标的影响Table 2 Effects of strain KSD17 on morphological indicators of potato

2.5 拮抗菌株KSD17 的鉴定

2.5.1 拮抗菌株KSD17 的形态及生理生化特性鉴定

菌株KSD17 在NA 培养基上呈乳白色，菌落表面无褶皱，边缘不规则，挑起菌落时较为粘稠、无色素产生（图4A）。经革兰氏染色后在光学显微镜下观察，菌株KSD17 菌体呈杆状，有芽孢（图4B）。

图4 菌株KSD17 的菌落形态Fig.4 Colony morphology of strain KSD17

测定菌株KSD17 的生理生化特性的检测结果（表3）。菌株KSD17 厌氧或兼性厌氧生长，氧化酶活性反应为阳性，不产生硫化氢气体；在高于5% NaCl培养基中生长受抑制；水解淀粉成阳性；菌株能利用葡萄糖、D-果糖、蔗糖、甘露醇且产酸；吲哚反应、硝酸盐还原反应、V-P 反应、MR 反应均呈阳性；脲酶、柠檬酸盐反应、丙二酸盐反应、精氨酸双水解酶、明胶反应呈阴性。

表3 菌株KSD17 的生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain KSD17

通过菌株KSD17 菌落形态和生理生化特征与布坎南、东秀珠和刘波等所列出的多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）描述一致。

2.5.2 拮抗菌株KSD17 的分子生物学鉴定

拮抗菌株KSD17 经PCR 扩增，获得16S rRNA基因序列长度为1 420 bp（登录号MV821402）。经BLAST 进行同源性比对，菌株KSD17 与多粘类芽孢杆菌相似度最高达99.15%，下载与KSD17 相似率高且有代表性的菌株。采用Mega7.0 软件进行遗传距离分析，KSD17 菌株与多粘类芽孢杆菌聚在一个分支（图5）。再结合菌落形态和生理生化指标测定，最终将菌株KSD17 鉴定为多粘类芽孢杆菌。

图5 系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree

3 讨论

研究从马铃薯根际土中分离得到多株细菌，通过平板对峙筛选得到菌株KSD17 对马铃薯黑痣病菌拮抗效果最好。菌株可以使立枯丝核菌菌丝膨大、弯曲、表面干瘪、皱缩，平板抑制率达78.91%，盆栽试验表明，KSD17 发酵液接种量240 mL 时对马铃薯黑痣病防治效果达66.17%，并促进马铃薯植株株高生长和匍匐茎数量，较CK 分别增加9.05%和22.04%。通过形态学、生理生化及16S rRNA 鉴定，将菌株KSD17 鉴定为多粘类芽孢杆菌。

生防菌株能够分泌水解酶类物质抑制或消除病原真菌。其中，羧甲基纤维酶和蛋白酶能够水解病原真菌细胞壁，而β-1，3-葡聚糖酶能够水解真菌侵染过程形成的芽管，芽管最外层的结构胞壁主要成分为葡聚糖[23]。Kim 等[24]从果树根际土壤中分离得到一株多粘类芽孢杆菌APEC136，对苹果炭疽病和白腐病具有很好的防治效果，菌株具有较高的蛋白酶活性，但纤维酶活性较低。Prapagdee[25]研究表明β-1，3-葡聚糖酶通过水解或抑制胶孢炭疽菌和齐整小核菌细胞壁β-1，3-葡聚糖的合成，从而抑制其病原菌生长。研究获得的多粘类芽孢杆菌KSD17 菌株能产生羧甲基纤维素酶、蛋白酶和β-1，3-葡聚糖酶，这可能是抑制马铃薯黑痣病菌机理之一，其产生羧甲基纤维素酶和蛋白酶的活力均较强，产生β-1，3-葡聚糖酶的活力较低。

关于多粘类芽孢杆菌的防治土传病害已有一些报道。黄艺烁等[26]通过盆栽试验发现，多粘类芽胞杆菌ZF197 可以在发生白菜茎基腐病的土壤中定值，显著降低白菜茎腐病病情指数，其防效达78.57%。张亮等[27]研究多粘类芽孢杆菌可以在发生番茄青枯病的土壤中定值，显著降低青枯病菌（Ralstonia solanacearum）丰富度。在分析菌株KSD17 拮抗效果的基础上，通过室外盆栽试验表明，菌株KSD17 处理对马铃薯黑痣病有较好的防效，达66.17%，推测多粘类芽胞杆菌KSD17 能在马铃薯根际土中定植。菌株KSD17 处理后对马铃薯植株株高和匍匐茎均显著提高；侧根数较CK 降低了26.65%。这与孙中华等[28]研究相类似，使用5%～20%枯草芽孢杆菌B67 菌液处理均能黄瓜幼苗茎粗、株高、根长和根管比均显著性增加，使用超过20%菌液浓度使黄瓜幼苗茎粗、株高、根长和根管比显著下降。菌株KSD17 的应用最适浓度还需要进一步探索。多粘类芽孢杆菌KSD17能显著降低马铃薯黑痣病发生，是一株具有开发潜力的生防菌，将对马铃薯黑痣病的绿色防控具有重要意义。