南充地区脊髓性肌萎缩症携带者筛查及高风险胎儿产前诊断分析

陈丽平,何勇均,蔡燕,石琪

(川北医学院附属医院,1.遗传与产前诊断中心;2.妇产科,四川 南充 637000)

脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy,SMA)是一种严重的常染色体隐性遗传性神经肌肉疾病,主要是位于5q13.2区域的运动神经元存活基因1(survival motor neuron,SMN1)致病性变异所致,当SMN1基因第7或第7、8外显子发生纯合缺失或点突变时引起SMN蛋白表达缺失,造成脊髓前角α运动神经元变性,导致近端肢体和躯干进行性、对称性肌无力和肌萎缩[1]。该病在新生儿中的发病率约为1/10 000[2],携带者频率为1/50～1/40。儿童型SMA(1～3型)的患病率为2.78～6.56人/10万人[3],其中4型SMA患病率约为0.32人/10万人[4]。SMA居<2岁儿童致死性遗传病首位,其中累及呼吸系统导致的呼吸衰竭是最常见的致死原因[5]。中国人群中的携带者频率约为1/42[6],但是各地区尚无发病率的确切数据。

SMA临床表现严重,人群中的携带率较高,且致病基因明确,2008年美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)[7]建议无论地域种族,应该对所有育龄人群进行SMA携带者筛查。目前已报道的SMA携带者筛查技术众多,根据SMA致病基因的特点,对SMN1基因外显子7、8缺失进行检测,已经成为SMA携带者筛查的首选方法[8]。目前尚无关于南充地区人群的SMA携带率的相关研究,本研究从此角度出发,采用多重连接依赖性探针扩增(MLPA)技术和荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)技术对南充地区4 325例因不良妊娠史就医的育龄期女性及183名配偶的SMN1基因进行检测,调查SMA携带率,为本地区的SMA的筛查及孕妇的产前诊断提供一定的指导。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选取2019年12月至2022年10月川北医学院附属医院收治的4 325例定期产检且因不良妊娠史就医的育龄期女性及183名配偶为研究对象,其中孕妇年龄(29.35±2.17)岁;孕周9～20周。本研究获得医院伦理委员会的批准,所有纳入的研究对象均进行检测前沟通,取得研究对象的知情同意并签署相关知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 样本采集 所有受检者均进行外周静脉血采集2 mL,采集后的血液进行EDTA抗凝,于4 ℃的环境中保存,对采集的血液样本均在1周内完成基因检测。

1.2.2 DNA提取 采用达安基因NP986-C系统进行外周血核酸的提取,采用NanoDropOne超微量生物检测仪进行DNA浓度检测。

1.2.3 基因检测 采用荧光定量PCR法对SMN1基因进行检测,检测试剂盒购自上海五色石公司,操作方案严格按照试剂盒说明书进行。PCR扩增条件为:95 ℃预变性(10 min)→95 ℃变性(15 s)→58 ℃退火延伸(60 s),共40个循环。采用FAM及VIC通道进行信号采集。若检测孕妇为SMA携带者,则对其配偶进行样本采集及检测,配偶检测方法同上。若配偶检出为SMA携带者,则进行胎儿的基因检测,经夫妇双方知情同意后,于妊娠的16～22周进行经腹壁羊膜腔穿刺术(B超引导下),用一次性无菌注射器缓慢抽取孕妇羊水10 mL,利用购自荷兰MRC-Holland公司的MLPA P060试剂盒(SALSA MLPA Kit P060-B2)经变性、杂交、连接以及扩增后,产物通过ABI3500基因分析仪(ThermFisher,美国)检测,验证SMN1基因拷贝数变异,数据使用Coffalyser V8.0软件分析。

2 结果

本研究纳入4 508例研究对象(育龄女性4 325例及部分女性的配偶183例),共检测到SMA携带者70例,携带率为1/64.4,其中E7和E8双位点杂合缺少的64例(1/70.4),E7位点杂合缺失6例(1/751.3)。对夫妻双方均为杂合性缺失胎儿的基因检测发现其为SMN1基因E7位点纯合缺失。基因拷贝数变异检测发现,胎儿SMN1基因为0个拷贝数,SMN2基因为3个拷贝数。将胎儿预后详细告知胎儿父母后,胎儿父母决定终止妊娠。见图1。

3 讨论

SMA是遗传性神经肌肉疾病的一种,主要因为脊髓前角细胞和低位脑干运动神经核团变性,导致不同程度的肌张力降低、肌萎缩,严重时可影响呼吸肌危及生命。该病常呈家族性,从胎儿期到成人不同年龄均可发病,且治疗方法有限,预后通常不佳。SMA治疗的研究领域近年来发展迅速,部分相关治疗药物已经成功获批上市,如索伐瑞韦、利司扑兰、诺西那生等[9],可从不同方面提高全长SMN蛋白水平,其他治疗方式(如神经保护治疗、SMN修饰基因治疗、肌肉激活治疗、干细胞治疗等)也相继取得了进展。上述治疗给SMA患儿带来了希望,但早诊断、早治疗极其重要[10]。目前药物必须依靠进口,售价高昂,普通家庭难以承担,因此,利用先进的技术对孕妇SMA携带率的筛查,预防SMA患儿的出生,是一种经济且有效的SMA防治方法,对减轻家庭的经济负担和社会的负担均有较好的价值。

对育龄期女性SMA携带情况进行筛查属于一级预防,不仅能避免SMA患儿的出生,而且还能够提高我国新生儿的人口质量。台湾地区在2005至2009年共计检测了10万余例孕妇,其中共检测出SMA携带者2 262例,携带率约为1∶48[11];2013年我国上海地区同样对4 719例孕妇进行了筛查,SMA携带率约为1∶52[12];随后相继有广西、云南及陕西地区报道了关于本地区的SMA筛查结果,其中以广西地区的携带率较低,约为1∶81[13]。目前尚没有南充市及周边地区关于SMA携带率的研究,本研究纳入4 508例研究对象(孕妇4 325例及部分配偶183例),共检测到SMA携带者70例,携带率为1/64.4,其中E7和E8双位点杂合缺少的64例(1/70.4),E7位点杂合缺失6例(1/751.3),基本符合当前我国的SMA携带者的流行病学调查结果。同时对夫妇均为SMA携带者的胎儿基因检测发现其为SMN1基因E7位点纯合缺失。MLPA技术检测发现,胎儿SMN1基因为0拷贝,SMN2基因为3个拷贝数,最终通过遗传咨询预防SMA患儿的出生。

SMA患儿的父母多为SMN1单拷贝携带者,但也约有4%的SMA携带者为两个SMN1拷贝位于同一染色体上,这种“2+0”型携带者目前缺少准确的检测技术,需要联合SMA患者父母的SMN1基因拷贝数和家族史调查来进行诊断评估。同时,现阶段对于家庭中有“2+0”类型携带者的夫妻,其再发风险和产前诊断策略缺少准确的检测技术,对于“2+0”类型携带者进行病例筛查与遗传咨询尤为关键[14]。目前临床上常用的技术是MLPA和荧光定量PCR,但因各自的缺点限制了其在大规模筛查中的应用。已有大量的研究数据表明,高通量测序(NGS)可以直接计算SMN1拷贝数,但筛查或诊断SMN1微小变异仍存在很大困难,目前在我国尚未成为SMA的常规检测方法。数字PCR(dPCR)法、高分辨率熔融分析法等新兴技术方法在临床SMA携带者筛查中有巨大的潜力。但由于dPCR法不能检测出SMN1基因内点突变以及沉默的SMA携带者(2+0),未来需要研究开发可以检测单核苷酸变化的dPCR技术,以适用于大规模的筛查[15]。

综上,本研究初步确定了南充地区SMA的携带率,同时对同为SMA携带者夫妻的胎儿进行了SMN1基因的检测,最终确定为SMA患儿并避免了此例患儿的出生,减轻了家庭及社会的负担。本研究也存在有一定的缺陷,如样本数目少,样本中配偶人数偏少,未进行SMN2基因的检测,因此可能会对本研究的结论造成一定的影响,后续有待研究的进一步完善。