自噬相关基因在Janus蛋白酪氨酸激酶抑制剂治疗类风湿关节炎前后患者外周血单个核细胞中的表达及其临床意义

廖霞,姚婷,谢泓源,余湘,雷天意,张全波,青玉凤

(川北医学院附属医院,1.风湿免疫科 ;2.老年科,四川 南充 637000)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是最常见的自身免疫病之一,全球发病率为0.5%～1%[1],我国发病率约为0.42%,女性多于男性[2]。RA除累及关节外,也常出现肺间质改变、心血管事件、慢性病贫血、恶性肿瘤等关节外表现。RA疾病的进展可能导致患者生活质量下降,死亡率增加[3-5]。早诊断、早治疗对于减少RA患者功能丧失,改善预后十分重要。目前RA发病机制尚不明确,与遗传、环境等因素相关[6-7]。近年来相关研究[8]发现,Janus蛋白酪氨酸激酶/信号转导和转录激活因子(janus protein tyrosine kinase/signal transducer and activator of transcription,JAK/STAT)信号通路的持续激活对RA的发病过程具有重要调控意义,以此为基础诞生了包括托法替布在内的一系列新型的口服(janus protein tyrosine kinase,JAK)抑制剂,并且在临床中逐渐得到应用。

自噬是一种广泛存在于真核生物中的降解机制,其主要作用是在溶酶体介导下降解或清除受损的细胞器和蛋白质聚集体及病原体从而维持细胞自身代谢及调节细胞稳态[9]。研究[10-12]发现,自噬的异常在心血管疾病、感染、衰老、肿瘤、神经系统疾病及自身免疫性疾病的发病过程中发挥重要作用。越来越多的研究[13-14]也发现自噬参与了RA疾病的发生发展。本研究欲探讨RA患者体内是否存在自噬的异常表达,并探索其与RA患者临床表现之间的关系,同时通过检测托法替布治疗前后自噬相关基因(autophagy-related genes,ATGs)表达水平的变化,以明确托法替布是否可通过调控自噬而发挥作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2020年6月至2021年6月于川北医学院附属医院门诊就诊的RA患者(RA组)30例为研究对象。纳入标准:符合2010年美国风湿病学会联合欧洲抗风湿病联盟关于类风湿患者分类标准[15];既往仅接受传统合成抗风湿药(conventional synthetic disease-modifying anti-rheumatic drugs,csDMARDs)治疗。排除标准:排除合并其他自身免疫性疾病、重要脏器疾病、感染、肿瘤、内分泌疾病患者及妊娠。选取同期川北医学院附属医院体检中心年龄、性别匹配的30名健康体检者为对照组(healthy control group,HC组),HC组实验室指标均正常,无自身免疫性疾病和家族史。本研究经医院伦理委员会审核通过,且全部患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 给药方式 予以枸橼酸托法替布片(正大天晴药业集团股份有限公司,H20193281),5 mg/次,2次/d,连续治疗24周。

1.2.2 临床资料与实验室指标 收集托法替布治疗前、治疗后24周RA患者的临床治疗反应性指标,包括健康评估问卷残疾指数(HAQ-DI)、关节肿胀数目(SJC)、关节压痛数(TJC)、28个关节疾病活动评分(DAS-28)、患者总体评估(PtGA)、DAS-28(ESR)疾病活动度分级、ACR20/50/70应答率、红细胞沉降率(ESR)、超敏C反应蛋白(hsCRP)、自身抗体(RF、CCP)。所有实验室指标均在川北医学院附属医院检验科完成。

1.2.3 引物合成 根据Pubmed Gene中ATG3、ATG5、ATG12、ATG16、Beclin-1、LC-3和β-actin人基因序列,采用Primier 6.0引物设计软件设计相应引物,由上海生工生物合成公司合成引物。见表1。

表1 引物序列

1.2.4 实时荧光定量法(RT-qPCR) 采用RT-qPCR检测RA患者及健康对照组外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMCs)中ATGs的表达水平。用肝素钠抗凝的外周静脉血3 mL,分离提取PBMCs,采用Trizol法提取总RNA,紫外分光光度仪测定总RNA浓度,取OD260/OD280在1.8～2.0的RNA反转录合成cDNA。RT-qPCR总体积为20 μL,反应体系:TB Green Premix Ex Taq II 5 μL,ROX Reference Dye II 0.2 μL,去离子水3.2 μL,正向及反向引物各0.3 μL,cDNA 1 μL。反应条件:第一步:95 ℃预变性3 min。第二步:95 ℃ 5 s→60 ℃ 34 s进行循环扩增,循环40次。溶解曲线阶段:95 ℃ 15 s→60 ℃ 1 min→95 ℃,每15 s 1个循环。每份标本均设两个复孔,反应结束后做溶解曲线。以目的基因的Ct值减去内参的Ct值为ΔCt,以2-ΔCt值表示目的基因mRNA表达水平。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 两组一般资料比较

两组研究对象年龄、性别构成比较,差异均无统计学意义(P>0.05),RA组ESR、hSCRP水平高于HC组(P<0.05)。见表2。

表2 两组一般资料比较

2.2 两组自噬基因mRNA表达水平比较

与HC组相比,RA组ATG5、Beclin-1、LC-3的mRNA表达水平均升高(P<0.05),ATG16的mRNA表达水平降低(P<0.05),ATG3、ATG12的mRNA表达水平无统计学差异(P>0.05)。见表3及图1。

表3 两组PBMCs中自噬相关基因mRNA表达水平比较

2.3 RA患者自噬基因表达水平与临床指标的相关性分析

ATG5与ESR、hsCRP、SJC、PtGA、DAS-28(ESR)、CCP正相关(P<0.05);ATG12与hsCRP、CCP正相关(P<0.05);ATG16与hsCRP、SJC正相关(P<0.05);Beclin-1与ESR、hsCRP、PtGA、DAS-28(ESR)正相关(P<0.05),与RF-IgG负相关(P<0.05);LC-3与ESR、hsCRP正相关(P<0.05)。见表4。

表4 自噬相关基因与RA患者临床指标相关性分析

2.4 RA组治疗前后自噬基因表达水平对比

治疗后,RA组经托法替布治疗24周后,ATG5、Beclin-1、LC-3的mRNA表达水平均降低(P<0.05),ATG16的mRNA表达水平升高(P<0.05),ATG3、ATG12的mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表5及图2。

表5 RA组治疗前后自噬相关基因mRNA表达比较

3 讨论

类风湿关节炎是一种弥漫性结缔组织病,可影响多个器官系统,对患者及家庭产生严重影响。相关研究[10-12]发现,自噬的异常上调或下调亦或是功能缺失在多种疾病的发病机制中发挥重要作用。研究[16]表明,自噬在类风湿性关节炎发病过程中发挥着重要作用:(1)诱导瓜氨酸化并呈递瓜氨酸肽给免疫细胞导致免疫炎症反应;(2)刺激破骨细胞生成并诱导其介导的骨吸收[17];(3)诱导并维持成纤维样滑膜细胞形成“调亡抵抗”[18];(4)调节淋巴细胞的激活和保存[19-20]。瓜氨酸化是指在肽基精氨酸脱亚胺酶(peptidyl-arginine-deiminase,PAD)的作用下,精氨酸被化学转化为瓜氨酸的过程。新生成的瓜氨酸蛋白抗原在自噬参与的条件下被呈递给T淋巴细胞并导致抗瓜氨酸抗体生成,后者能够分化为破骨细胞,从而促进骨丢失和破坏[21]。

本研究中,与HC组相比,RA组患者的ATG5、Beclin-1、LC-3的mRNA水平均呈高表达,与Zhu等[22]的研究结果一致,提示ATG5、Beclin-1、LC-3等自噬基因的上调可能参与RA的发病;但与之不同的是我们发现RA患者ATG16的mRNA表达水平降低。Saitoh等[23]研究中也发现在ATG16功能缺失的巨噬细胞中白细胞介素1、白细胞介素18表达增加,表明ATG16可能发挥着抑制某些炎症因子表达从而发挥免疫作用。此外,Hamaoui等[24]研究也强调了ATG16除在自噬发生过程中发挥重要作用,还广泛作为炎症的制动器发挥作用从而维持细胞稳态。因此推测ATG16在RA中可能发挥着抑制炎症的作用。

既往研究[22-24]及本研究结果均表明RA患者体内的确存在自噬的异常,为了明确自噬异常对RA患者临床症状及疾病活动性的影响,本研究进一步进行了相关性分析,结果发现ATG5、ATG12、ATG16、Beclin-1、LC-3与ESR、hsCRP、CCP等指标呈现不同程度的正相关关系。在RA患者中,我们通常将ESR及hsCRP作为判断患者疾病活跃的参考指标,而将RF和CCP抗体滴度作为判断患者病情严重程度及疾病预后的预判指标。上述结果表明在活动性RA患者中,其自噬水平高低与疾病活动性、炎症指标、关节肿胀等临床指标密切相关,降低自噬相关基因的表达水平可能成为类风湿关节炎治疗的新靶点。

托法替布是一种新型的口服小分子药物,主要通过靶向抑制JAK/STAT信号通路发挥治疗目的。最近一项在Clec16aKO小鼠中的研究[25]结果表明,托法替布对自噬的影响可能是通过抑制JAK/STAT信号通路中STAT1、STAT3发挥作用。以此为基础,本研究检测了托法替布治疗24周后RA患者的ATGs的表达水平,发现ATG5、Beclin-1、LC-3的基因表达水平降低,而ATG16基因表达水平升高,提示托法替布可能通过影响自噬相关基因的表达而参与自噬调节。但是由于目前缺乏托法替布对RA患者自噬影响的直接研究,因此关于托法替布对RA患者自噬影响的具体机制尚不明确。

综上,RA患者体内存在自噬基因的异常表达且与疾病活动性和炎症水平等密切相关,提示自噬可能成为未来RA治疗的新靶点。此外,托法替布可通过调控部分自噬基因的表达从而影响自噬,可能为其治疗RA的新途径,亦可能成为潜在的自噬调控剂,但其具体作用机制有待进一步研究。