烟曲霉暴露对哮喘大鼠气道微环境的影响及药物干预的作用

周霞 杜春玲

支气管哮喘(简称哮喘)是一种以气道高反应性为特征的慢性气道炎症性疾病,气道微环境改变可能适合烟曲霉定植,而后者又是炎症慢性化的主要原因[1]。气道黏液纤毛系统发挥作用依赖适宜的微环境。研究发现,囊性纤维化患者气道氯离子分泌及钠离子吸收引起纤毛层厚度减少和粘液分泌增加,导致气道防御受损,有利于细菌生长及炎症爆发[2]。纤毛层含有黏蛋白[3],烟曲霉暴露可上调哮喘气道MUC5AC表达,有利于曲霉粘附定植[4]。研究还发现气道pH值是上皮屏障和先天防御的重要决定者[5]。然而,对哮喘、真菌定植与气道微环境的关系研究较少,药物对气道微环境的影响也不明确。因此,本研究主要观察糖皮质激素、抗生素对哮喘气道微环境及烟曲霉孢子清除力的影响。

资料与方法

一、材料

1 实验动物

Wistar大鼠购于上海斯莱克实验动物有限责任公司,SPF级雄性,体重180～200g,实验前于复旦大学医学院动物房适应性饲养一周,恒温环境(23℃),相对湿度(40%),12小时昼夜,自由进食和取水,并观察生长情况。动物饲养及实验方案均严格按照复旦大学动物伦理委员会动物实验规范执行(SYXK2014-0029)。

2 烟曲霉菌株

AF293烟曲霉标准株为复旦大学附属华山医院真菌室保存菌株馈赠。由肺曲霉菌病患者临床痰液标本中分离并鉴定而得。

3 主要试剂

卵白蛋白(Grade V,美国Sigma公司),氢氧化铝(美国Sigma公司),乙酰甲胆碱(美国Sigma公司),注射用地塞米松磷酸钠注射液(马鞍山丰原制药),注射用头孢曲松钠(悦康药业集团有限公司),BCA蛋白测定试剂盒(江苏碧云天生物技术有限公司),乳酸脱氢酶试剂盒(南京建成生物工程研究所);马铃薯葡萄糖琼脂培养基(上海盛思公司),易氟烷(美国百特公司),戊巴比妥钠(德国默克公司)。

4 主要仪器设备

压缩式雾化器(型号AG CLASSIC,飞利浦公司),血气、电解质生化分析仪(型号cobas b 221,罗氏诊断产品上海有限公司),组织匀浆机(型号Tissuelyser-24,上海净信公司)。

二、动物分组及干预方案

40只雄性Wistar大鼠随机分为5组,每组8只。1)空白对照组;2)单纯哮喘组;3)哮喘+孢子组;4)地塞米松组;5)头孢曲松组(见表1)。

表1 动物分组及干预方法(n=8)

三、哮喘模型的建立

根据我们前期的研究方案造模[6]:单纯哮喘组和哮喘+孢子组于实验第1、8天给予OVA悬液腹腔注射致敏(1 mL/只,1 mg OVA+100 mg氢氧化铝溶于1 mL无菌生理盐水中,现配现用);第15天起,将大鼠置于透明密闭雾化箱(20cm×40cm×50cm)中给予连续6周的1% OVA悬液雾化吸入以激发哮喘(每周5次,每次30 min)。空白对照组予生理盐水致敏、激发作为对照处理。

四、药物干预方法

1 地塞米松组和头孢曲松组哮喘模型建立同单纯哮喘组。地塞米松组于1% OVA激发期间给予每周3次(每周一、三、五,雾化前30分钟),0.5 mg/kg 地塞米松腹腔注射;头孢曲松组于1% OVA激发期间给予每周3次(每周一、三、五,雾化前30分钟),50 mg/kg头孢曲松钠腹腔注射。

2 烟曲霉孢子滴鼻:第57天起,哮喘+孢子组、地塞米松组、头孢曲松组于异氟烷麻醉后垂直位放置,用移液枪吸取100 μL 1.0×107/mL 烟曲霉孢子悬液缓慢滴入每侧鼻腔,连续3天;空白对照组、单纯哮喘组给予生理盐水滴鼻作为对照。

五、标本收集

腹腔注射2 %戊巴比妥钠麻醉大鼠后腹主动脉取血,3000 rpm/min(有效离心半径为10 cm),4℃,离心15 min,取上清于-80 ℃冻存。结扎右肺根部后气管插管并固定,使用无菌PBS行左肺肺泡灌洗,3次共10 mL,肺泡灌洗液(BALF)于1000 rpm/min(有效离心半径为10 cm),4℃,离心10 min,取上清于-80 ℃冻存。取右肺上叶迅速置入4 %多聚甲醛中固定、脱水、石蜡包埋,5 μm厚切片。

六、指标检测

全血和BALF收集后(0～4℃ 保存)取2 mL立即使用罗氏血气分析仪测定pH值和电解质浓度。按BCA蛋白测定试剂盒说明书检测血清和BALF中总蛋白质含量。根据试剂盒说明书,使用微板法测定BALF和血清中乳酸脱氢酶(LDH)活力。

七、烟曲霉菌定植的观察

取大鼠肺组织的相同部位,称重、匀浆(100 mg/mL PBS,置于无菌EP管中)。取肺组织匀浆液和BALF各100 μL均匀涂于加有双抗的PDA培养基,37 ℃培养24 h后肉眼观察菌落形成。

八、统计学分析

结 果

一、各组大鼠血和BALF中pH值、电解质水平的比较

空白对照组、单纯哮喘组、哮喘+孢子组三组比较,单纯哮喘组血和BALF K+水平较空白对照组无显著变化(P>0.05),而哮喘+孢子组血K+水平较空白对照组明显降低[(6.50±0.59)mmol/Lvs(8.00±0.92) mmol/L,P=0.003],同时BALF K+水平明显升高[(2.39±0.38)mmol/Lvs(1.87±0.27)mmol/L,P=0.009]。哮喘+孢子组大鼠血中K+水平较单纯哮喘组有所降低[(6.50±0.59 )mmol/Lvs(7.70±1.35)mmol/L,P=0.052]、BALF中K+水平有所上升[(2.39±0.38)mmol/Lvs(2.04±0.19)mmol/L,P=0.053],血和BALF二者间的K+浓度差在哮喘+孢子组和单纯哮喘组间比较具有统计学差异(P=0.025)。哮喘+孢子组、地塞米松组、头孢曲松组三组比较,地塞米松组和头孢曲松组血和BALF中K+水平较哮喘+孢子组无明显改变。各组大鼠血和BALF中的pH值、Na+、Cl-、Ca2+(BALF中Ca2+检测均大于上限)水平无显著性差异(见表2,3)。

表2 各组大鼠血中电解质含量和pH值的比较

表3 各组大鼠BALF中电解质含量和pH值的比较

二、各组大鼠血清和BALF中总蛋白、LDH活力的比较

空白对照组、单纯哮喘组、哮喘+孢子组三组比较,单纯哮喘组血清和BALF中总蛋白水平较空白对照组无显著变化(P>0.05),而哮喘+孢子组血清和BALF蛋白水平均较空白对照组明显升高[血清(1987.96±139.41) mg/mLvs(1633.34±292.23) mg/mL,P=0.035;BALF (8.92±0.75) mg/mLvs(5.83±1.21) mg/mL,P<0.001]。哮喘+孢子组血清和BALF中的总蛋白含量较单纯哮喘组均明显增加[血清(1987.96±139.41 ) mg/mLvs(1634.53±210.71) mg/mL,P=0.014;BALF (8.92±0.75) mg/mLvs(4.66±1.38) mg/mL,P<0.001]。哮喘+孢子组、地塞米松组、头孢曲松组三组比较,头孢曲松组血清和BALF中的总蛋白含量较哮喘+孢子组均明显减少[血清(1743.46±187.09) mg/mLvs(1987.96±139.41) mg/mL,P=0.047;BALF (4.94±1.72) mg/mLvs(8.92±0.75) mg/mL,P=0.002],而地塞米松组较哮喘+孢子组无显著变化。各组间血清LDH活力无显著性差异,BALF中检测不到LDH活性(见表4)。

表4 各组大鼠血和BALF中总蛋白含量以及LDH活性的比较

三、各组大鼠肺组织烟曲霉培养的观察

PDA培养结果显示,空白对照组、单纯哮喘组肺组织匀浆和BALF培养均未见烟曲霉菌落形成,哮喘+孢子组、地塞米松组、头孢曲松组肺组织匀浆烟曲霉阳性率分别为50%(4/8)、100%(7/7)、50%(4/8),BALF烟曲霉阳性率分别为50%(4/8)、57%(4/7)、50%(4/8)(见表5和图1)。

表5 肺组织匀浆、BALF烟曲霉培养阳性率(n=8)

图1 各组大鼠肺组织、BALF烟曲霉培养的观察

讨 论

在世界范围内,约18%～50%的家庭存在室内真菌暴露,主要为烟曲霉菌和青霉菌,真菌暴露与哮喘发病及急性加重有着明确的因果关系[7]。烟曲霉菌是一种广泛存在于环境中的重要的条件致病菌,其微小的孢子结构使之吸入后易于达到宿主肺泡,通过菌丝生长而定植于气道内或引发侵袭性感染[8]。不合理使用抗生素、糖皮质激素引起的生态紊乱和免疫抑制是诱发机会性真菌感染的重要因素[9-10],而真实世界研究表明抗生素使用对哮喘加重患者有益的证据非常有限[11-13]。在本研究中,我们发现地塞米松组肺组织匀浆(100%)和BALF(57%)的烟曲霉培养阳性率明显增加,头孢曲松组肺组织匀浆烟曲霉菌落形成数量也明显高于哮喘+孢子组,表明糖皮质激素和抗生素使用增加了哮喘大鼠真菌感染的风险。但是,哮喘+孢子组肺组织匀浆和BALF烟曲霉阳性率也各达50%,这可能与哮喘慢性气道炎症所致上皮细胞损伤脱落以及基底膜暴露等病理变化有助于烟曲霉孢子在气道内粘附以及肺内滞留有关[1]。

气道微环境稳态(酸碱稳态、离子浓度稳态、葡萄糖稳态等)对发挥气道正常粘液纤毛清除功能及抗菌效应至关重要。本研究中,我们发现烟曲霉暴露使哮喘大鼠血中的K+浓度降低,肺泡灌洗液中的K+浓度升高,既往研究也发现哮喘患者低钾血症发生率(28.6%)明显高于肺炎对照组(7.3%)[14]。此外,还有研究发现,哮喘患者下呼吸道浸润的T细胞中钾离子通道Kv1.3高表达,其选择性抑制剂可减少哮喘大鼠Th2型细胞因子的产生[15]。烟曲霉暴露造成哮喘大鼠血钾降低的原因可能为哮喘大鼠过度通气引起呼吸性碱中毒,血H+浓度降低使细胞内H+转移到细胞外,H+-K+交换又使K+进入细胞内而引起转移性低钾血症[16]。但在本研究中,烟曲霉暴露的哮喘大鼠其血液和气道是否存在离子通道的开放及钾离子的流动,目前不明确,需进一步探究。

本研究中还发现烟曲霉暴露使哮喘大鼠血清和BALF中总蛋白含量明显升高,既往研究也显示在暴露于组胺型介质(白三烯、前列腺素、血小板活化因子、缓激肽)数分钟后,人和豚鼠气道表面液体中血浆蛋白的含量显著增加[17],研究者们也提出了“血浆大分子渗出可能是气道粘膜第一道防线的一部分”的理论[18-19]。气道蛋白渗出也在一定程度上反映了肺泡毛细血管屏障功能障碍,头孢曲松钠在本研究中具有较好改善毛细血管通透性的作用,但考虑到其增加机会性感染的风险,需权衡利弊后使用。

综上所述,烟曲霉暴露、糖皮质激素和抗生素使用改变了哮喘大鼠气道微环境,增加了真菌气道定植甚至肺内感染的风险。但关于哮喘气道微环境稳态的确切调节机制(如钠钾泵的运转等)有待更深入的研究。