遮光处理对盆景灵芝生长发育和酶活性的影响

金鑫， 张璐， 吴鹏， 李萍， 谭伟， 桂明英*

（1.四川省农业科学院生物技术核技术研究所，成都 610061； 2.云南省高原特色农业产业研究院，昆明 650100； 3.四川省农业科学院农业资源与环境研究所，成都 610066）

灵芝[Ganoderma lucidum（Lesyss ex Fr.）Karst]为担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌，作为一种重要的食药用真菌，自古以来就是我国一味传统的名贵中药[1]。现代药理学研究证实，灵芝主要活性物质为灵芝多糖、三萜、可溶性蛋白、氨基酸、核苷类等，具有调节免疫、抗肿瘤、抗衰老、保肝护肝、治疗心脑血管疾病等功效[2-4]。灵芝还是吉祥如意的象征，可做成天然的观赏品灵芝盆景，活跃花卉市场、美化环境、陶冶情操。制作灵芝盆景需要美丽的外形和鲜艳的颜色，因此，灵芝子实体外形和菌盖颜色是培养出高观赏价值灵芝盆景的关键。

光作为植物生长发育最重要的环境因素之一，控制并决定着植物的生长、发育和分化等过程[5]。与植物相比，灵芝主要将光作为一种外界信号，而非能量来源，在不同光照条件下灵芝子实体的生长速度、形状、代谢产物含量以及各类酶活性特征会发生相应变化。夏至兰[6]报道，在灵芝的生长期通过控制光照条件、空气湿度等环境因素，可培育成外形美观、喻意吉祥的观赏植物；孙立晨等[7]通过白膜遮挡处理研究发现，光照强度越大灵芝中丙二醛含量越高；余吴梦晓等[8]通过蓝光和自然光处理栽培灵芝，发现蓝光对灵芝子实体产量有明显的促进作用，且能够促进多糖的积累，提高糖代谢相关酶的活性；郝俊江等[9]研究表明，不同光质处理对灵芝子实体产量和灵芝孢子粉产量均有影响，蓝色光质可以使灵芝子实体维持较高的抗氧化酶活性水平，促进可溶性蛋白合成，从而增强灵芝代谢，延缓灵芝衰老。在灵芝生长过程中，合适的光照强度尤为重要，当光照强度过高时，子实体生长缓慢，菌盖表面色泽较差；当光照强度较弱时，菌盖分化困难，柄长，盖薄，子实体细小。因此，研究不同遮光处理下灵芝生长发育及抗氧化酶的响应，对了解盆景灵芝适应逆境的生理机制有重要意义，本研究以盆景灵芝菌株为试验材料，通过不同光照强度处理，探讨遮阳率对盆景灵芝生长及体内酶活性的的影响，以期为盆景灵芝的生产栽培提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料

以‘盆景灵芝3号’菌株为试验材料，由四川省农业科学院生物技术核技术研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 段木栽培2019年1—8月在德阳市食用菌专家大院实验研究基地开展盆景灵芝栽培试验，在研究地周边购买栎树，选取直径为8～20 cm树木，将树木切割成15 cm长的小原木，选取30 cm×40 cm×0.005 cm的聚丙烯有底菌袋，将原木装入袋内，扎紧口袋，121 ℃高压灭菌5 h；然后进行接种，25 ℃室内发菌60 d，于4月上旬将发菌好的短原木下地栽培。

1.2.2 试验设计采用黑色遮阳网（江苏钦农农业发展有限公司）来控制光照强度，试验共设置4个处理，包括露天不遮光（遮阳率0%，T0）和分别采用3针加密遮阳网（遮阳率50%，T1）、6针加密遮阳网（遮阳率70%，T2）和8针加密遮阳网（遮阳率90%，T3）进行遮阳处理。每个处理大棚栽培规格为：长6 m×宽4 m，高1.8 m，每个处理3次重复，共计12个栽培棚。每个棚均采用相同盆景灵芝出芝管理方法。

1.2.3 样品采集 通过短原木大棚栽培获得盆景灵芝子实体，将盆景灵芝生长分为4个时期：原基形成期（primordium formation stage，S1）、菌柄形成期（stipe formation stage，S2）、菌盖分化期（cap differentiation stage，S3）和子实体成熟期（fruiting body maturity，S4）。灵芝不同生长期特征如表1和图1所示。

图1 盆景灵芝生长的不同时期Fig. 1 Different periods of bonsai Ganoderma lucidum growth

表1 盆景灵芝不同生长期特征Table 1 Characteristics of different growth periods of bonsai Ganoderma lucidum

1.2.4 不同生长时期灵芝子实体活性成分测定分别在灵芝生长的原基形成期（S1）、菌柄形成期（S2）、菌盖分化期（S3）和子实体成熟期（S4）采集样品，每个大棚随机采集9个样品，进行多糖、三萜和可溶性蛋白含量的测定。多糖含量采用苯酚硫酸法测定[10-11]，三萜含量测定采用香草醛-冰乙酸-高氯酸显色法测定[10,12]，可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝法测定[13]。

1.2.5 盆景灵芝不同生长时期体内木质素酶活性测定 采用随机混合取样法，分别在灵芝生长的原基形成期、菌柄形成期、菌盖分化期、子实体成熟期进行取样。每个处理采集9个样品，随机3个样品1组，对每组样品进行酶活性测定，灵芝子实体内锰过氧化物酶（manganese peroxidase）和漆酶（laccase）活性的测定方法参考李文涛等[14]和王学奎等[15]方法。

1.2.6 盆景灵芝不同生长时期体内抗氧化酶活性的测定 灵芝样品采集方法同1.2.5，每个样品取0.1 g，加入4 ℃的磷酸缓冲液5 mL，研磨，在4 ℃10 000 r·min-1离心10 min，收集上清液用于酶活性测定。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性测定采用邻苯三酚自氧化法[16]，过氧化物酶（peroxidase，POD）活性测定采用愈创木酚法[15]，过氧化氢酶（catalase，CAT）活性的测定参照Barata等[17]的方法。

1.2.7 盆景灵芝不同生长时期体内丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的测定 参照李合生[13]的方法，取0.1 g样品，加入5%三氯乙酸5 mL，冰浴研磨，所得匀浆5 000 r·min-1离心10 min，取上清液2 mL，加0.67%硫代巴比妥酸2 mL，混合后100 ℃水浴30 min，冷却后5 000 r·min-1下离心10 min。分别测定上清液在532和600 nm处吸光值。

1.3 数据分析

采用 Excel 2013 软件进行试验数据的统计分析；利用IBM SPSS 22软件进行独立样本t检验，采用Origin 8.0进行绘图。

2 结果与分析

2.1 光照强度对盆景灵芝子实体生长发育的影响

盆景灵芝子实体生长发育如表2所示。4个处理的灵芝从下地后7～8 d开始见到原基生长，T0处理的出原基时间较其他处理晚1 d，可见，遮阳处理能促使灵芝提早长出原基。从原基期到菌柄形成期，T2处理的原基个数最多，达140.58个；T0处理最少，仅113.50个；遮阳处理间原基个数差异不显著（P＞0.05）。菌盖生长阶段（图2），T0处理的子实体生长较差，生长不整齐，菌盖形状呈畸形、不规则，菌盖表面颜色较淡，没有光泽，同时易滋生虫害；而遮阳处理（T1、T2、T3处理）的子实体均能正常生长成朵形，其中，T1处理菌盖分化整齐度一般，菌盖表面呈黄色，光泽度较好；T2处理菌盖分化整齐度较好，菌盖表面金黄色，颜色鲜亮，光泽度好；T3处理菌盖分化整齐度较差，菌盖边缘白色明显，中间呈暗褐色和红色，光泽度一般。由此可见，光照强度不仅对原基形成时间、原基个数有影响，还对菌盖形状、颜色、光泽度有较大影响，总体来看，70%遮阳率最有利于盆景灵芝生长发育。

图2 不同处理下盆景灵芝的生长Fig. 2 Growth of bonsai Ganoderma lucidum under different treatments

表2 不同处理下盆景灵芝子实体的生长发育Table 2 Growth and development of bonsai Ganoderma lucidum fruiting bodies under different treatments

2.2 光照强度对盆景灵芝子实体农艺性状和产量的影响

在盆景灵芝子实体成熟阶段对灵芝菌盖直径、菌盖厚度、菌柄长度和第一潮子实体干产量进行测量，结果（表3）表明，T2处理的菌盖直径、菌盖厚度、菌柄长度和产量均表现最好；T1处理次之；而T0处理表现最差；不同处理间均存在显著差异（P＜0.05）。由此表明，当阳光直晒时，盆景灵芝的菌盖小、薄，菌柄短，产量低；当遮阳率为50%时，菌盖的直径和厚度及菌柄长度、产量显著增加；当遮阳率达到70%时，菌盖的直径和厚度及菌柄、产量表现最优；然而继续增加遮阳率，当遮阳率达到90%时，菌盖的直径和厚度及菌柄长度、产量则显著降低。可见，盆景灵芝的生长期需要适宜的遮阳率，以70%遮阳率对灵芝的生长效果最佳。

表3 不同处理下盆景灵芝的农艺性状和产量Table 3 Agronomic characteristics and yield of bonsai Ganodermalucidum under different treatments

2.3 光照强度对盆景灵芝不同生长期子实体内活性成分含量的影响

由表4可知，不同处理盆景灵芝子实体在原基期、菌柄期、菌盖期、成熟期多糖和三萜含量的变化趋势相同，都表现为在原基期含量最低，然后逐渐升高，在成熟期达到峰值；而可溶性蛋白含量在原基期最低，然后逐渐升高，在菌盖期达到峰值，至成熟期又逐渐下降。多糖含量在灵芝生长的4个时期中均表现为遮阳处理显著高于T0处理；在遮阳处理中，在原基期和菌柄期，不同处理间多糖含量差异不显著，而在菌盖期和成熟期，T2处理显著高于T1处理，与T3处理差异不显著，可见，阳光直晒会降低灵芝子实体中的多糖含量，一定程度的遮阳有利于提高子实体多糖含量。4个处理灵芝子实体的三萜含量均在原基期最低，成熟期最高；在原基期，T2含量最高，T0处理次之，T3处理最低；在菌柄期，T1处理最高，T2处理次之，T3处理最低；在菌盖期和成熟期，T2处理最高，T1处理次之，T3处理最低，可见，遮光率为90%时，灵芝子实体三萜含量较低，不利于子实体内三萜的合成，遮光率在0%～70%时，光照对灵芝子实体内三萜含量的影响较小。4个处理灵芝子实体内的可溶性蛋白含量均在原基期最低，菌盖期最高；且4个时期均表现为T0处理最高，T1处理次之，T3处理最低，可见，阳光直晒能提高灵芝子实体内可溶性蛋白含量，随着遮阳率的增加，子实体内可溶性蛋白含量逐渐降低。

表4 不同处理下盆景灵芝额活性成分含量Table 4 Contents of active ingredients of bonsai Ganoderma lucidum under different treatments

2.4 光照强度对灵芝不同生长时期体内木质素酶活性的影响

锰过氧化物酶和漆酶是灵芝生长发育过程中2种重要的木质素降解酶，其活性高低对灵芝木质素的降解能力和灵芝品质具有重要影响。由图3可知，光照强度对灵芝不同生长时期体内锰过氧化物酶、漆酶活性有显著影响。锰过氧化物酶在原基期活性最高，然后缓慢降低，到菌盖期其活性出现急剧下降，成熟期时其活性相对平稳；而漆酶在原基期活性最低，然后急剧升高，在菌盖期活性最高，成熟期时其活性又显著降低。不同处理间进行比较（图3），T0处理的锰过氧化物酶、漆酶活性均显著低于遮阳处理；T2处理的锰过氧化物酶、漆酶活性最高，显著高于其他处理。4个时期盆景灵芝子实体的锰过氧化物酶、漆酶活性均表现为T2＞T1＞T3＞T0。可见，阳光直晒和高遮阳率都会降低子实体内锰过氧化物酶和漆酶活性，而适度遮阳有利于锰过氧化物酶和漆酶活性的提高，以70%遮阳率为宜。

图3 不同处理下盆景灵芝的木质素酶活性Fig. 3 Ligninase activity of bonsai Ganoderma lucidum under different treatments

2.5 光照强度对盆景灵芝不同生长期体内抗氧化酶活性的影响

超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）是植物抵御外界伤害的重要抗氧化酶，能够维持体内的活性氧代谢平衡。

2.5.1 SOD活性变化 如图4所示，盆景灵芝在4个时期均表现为T2处理的SOD活性最高，T3处理最低。灵芝从原基期到成熟期，4个处理的SOD活性均表现为先上升后降低，其中，T0处理的增幅最大，T3处理次之，T2处理最小。在原基期，T2和T1处理的SOD活性显著高于T0和T3处理，T3又显著低于T0处理。在菌柄期和菌盖期，T2处理的SOD活性显著高于其他处理，较T0处理分别显著增加23.94%和32.52%。可见，强光和弱光均对盆景灵芝细胞产生了胁迫，使其体内积累了大量的自由基，而70%遮阳率在一定程度上缓解或解除了逆境胁迫，有利于盆景灵芝生长。另外，盆景灵芝处在成熟期时，体内SOD活性均呈降低趋势，这可能是由于盆景灵芝成熟后，体内细胞呼吸作用逐渐减弱，逆境胁迫对其造成的影响逐渐变小，从而导致体内SOD活性逐渐降低。

图4 不同处理下盆景灵芝的SOD活性Fig. 4 SOD activity of bonsai Ganoderma lucidum under different treatments

2.5.2 CAT活性变化 CAT可将H2O2分解为O2和H2O，是一种重要的抗氧化酶。如图5所示，随着灵芝的生长发育，体内CAT活性逐渐升高，在菌柄期达到峰值，然后急剧下降，到成熟期降至最低。不同处理间进行比较发现，在整个生长周期内T2处理的CAT活性均最高，显著高于其他处理，T3处理的CAT活性最低；且T2处理CAT活性在不同时期间的变幅也较大。在原基期、菌柄期、菌盖期和成熟期，T2处理CAT活性较T3处理分别显著提高68.41%、69.56%、62.50%和50.00%。可见，适度遮阳有利于提高盆景灵芝的CAT活性。

图5 不同处理下盆景灵芝的CAT活性Fig. 5 CAT activity of bonsai Ganoderma lucidum under different treatments

2.5.3 POD活性变化 由图6可知，POD活性的变化趋势与SOD、CAT不同，在原基期，POD活性较低；到菌柄期逐渐下降；而到菌盖期则急剧上升；之后至到成熟期又呈下降趋势。在原基期、菌盖期和成熟期均表现为T2处理的POD活性最高，显著高于其他处理；T0处理最低。在菌柄期，T2处理的POD活性最高，与T1处理差异不显著，但显著高于T0和T3处理；T3处理最低。可见，遮光处理对盆景灵芝体内POD活性有较大影响。

图6 不同处理下盆景灵芝的POD活性Fig. 6 POD activity of bonsai Ganoderma lucidum under different treatments

2.6 光照强度对灵芝不同生长时期体内MDA含量的影响

由图7可知，在盆景灵芝整个生长发育过程中，其体内MDA含量呈上升趋势，在原基期最低，成熟期最高。从原基期到菌盖期，灵芝体内MDA含量表现为T3＞T0＞T1＞T2，且处理间均存在显著差异；在成熟期，灵芝体内MDA含量表现为T0＞T3＞T1＞T2，且T0和T3处理显著高于T1和T2处理。在原基期，T3处理的MDA含量最高，T2处理最低，可见，在原基期时盆景灵芝需要较多的光照，过度遮阴对灵芝生长影响较大。综上所述，过度遮阴和过度直晒都严重影响灵芝的生长发育，只有适度遮阴才能减缓光照强度对细胞膜的损伤，促进灵芝生长发育。

图7 盆景灵芝不同生长期MDA含量Fig. 7 MDA content of bonsai Ganoderma lucidum under different treatments

3 讨论

3.1 光照强度对灵芝活性成分的影响

食用菌生长发育过程中，光照是重要的环境因素，食用菌不同种类或同一种类不同生长发育时期对光照条件的需求不同[18]。在灵芝栽培的发菌阶段，光照过强不仅会抑制菌丝的生长，还会导致菌丝分泌色素体提前老化；而在灵芝子实体生长阶段则需要适度的光照作为诱导。光强作为关键的环境因素之一，不仅影响灵芝子实体的形态特征，还对灵芝的生长发育和代谢物质形成有着重要影响。袁学军等[19]研究发现，灵芝中多糖、三萜和蛋白质含量受光照强度影响较大，自然光照强度下蛋白质含量较高、多糖含量较低，适度遮阳处理提高了三萜含量，降低了蛋白质含量。孙恬等[20]通过覆盖不同颜色的光膜来改变灵芝栽培大棚的光照强度，弱光照强度处理子实体的多糖和三萜含量显著高于强光照处理。本研究通过覆盖不同密度遮阳网研究了不同光照强度对盆景灵芝生长发育及体内活性成分含量的影响，结果显示，无遮阳处理时灵芝子实体的多糖含量较低，可溶性蛋白含量较高；遮阳率为70%时多糖含量较高；遮阳率为90%时，三萜含量较低，与前人研究结果一致。由此可见，光照强度不仅影响灵芝的生长发育，还会影响灵芝内次生代谢物含量。因此，明确具体的遮光度对于提高盆景灵芝性状具有重要的理论和实践意义。光照强度对灵芝生长发育的作用机制十分复杂，并受外部多种环境因素影响，其具体的作用机制还有待进一步研究。

3.2 光照强度对灵芝木质素酶活性的影响

灵芝作为一种重要的白腐真菌，可分泌漆酶和锰过氧化物酶。漆酶不仅能够降解环境中的木质素，还具有聚合木质素的作用，单独存在时降解木质素的效率较低，与锰过氧化物酶等共同作用才能实现较高的木质素降解效率[21]。漆酶和锰过氧化物酶作为灵芝分泌的胞外酶，在灵芝生长发育过程中通过降解环境中的木质素为灵芝提供营养成分，促进灵芝的生长发育及形态建成。研究表明，在灵芝的生长过程中，只有胞外酶活性的动态变化符合其生长发育规律才能使灵芝由菌丝体阶段向子实体阶段转变[22]。光作为灵芝子实体生长阶段重要的外部环境因素之一，不仅会影响灵芝子实体的活性代谢物质，还对灵芝生理生化反应具有调控作用，研究表明，当光照条件适宜植物生长时，其木质素酶活性较稳定，当光照条件对植物生长造成胁迫时，木质素酶活性则发生较大变化，这种应变性使植物能更好地适应外部环境[23]。本研究通过覆盖不同密度遮阳网研究了光照强度对盆景灵芝不同生长时期体内木质素酶活性的影响，结果表明，光照强度对盆景灵芝子实体内漆酶和锰过氧化物酶活性有显著影响，随着遮阳率的加重，锰过氧化物酶活性逐渐降低，而漆酶活性先升高后降低。其中漆酶在原基期时活性最低，然后急剧升高，在菌盖期活性最高，到成熟期活性又显著降低；而锰过氧化物酶在原基期活性最高，然后逐渐降低到菌柄期，到菌盖期活性急剧降低，成熟期相对平稳。综上所述，过度光强和过度遮阳均会降低盆景灵芝子实体内锰过氧化物酶和漆酶活性。

3.3 光照强度对灵芝抗氧化酶活性的影响

抗氧化酶系统是生物应对环境胁迫时重要的防御体系，由超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）等组成，能够有效地缓解环境胁迫对其造成的损伤。为探讨光照对灵芝抗氧化酶系统的影响，王立华等[24]研究发现不同光质处理灵芝的抗氧化酶活性差异较大，绿光处理下POD活性变化较大，白光处理下CAT活性较高，黑暗处理下SOD活性较高；郝俊江[25]研究发现蓝色可使灵芝子实体维持较高的抗氧化酶活性水平。由此表明，灵芝生长需要一定的光照。然而这些研究主要集中于不同光质对灵芝菌丝体、子实体生长的影响。本研究采用不同光照强度处理盆景灵芝，研究了其不同生育期抗氧化酶活性的变化，结果表明，不同光照强度处理下灵芝体内抗氧化酶活性存在显著差异，当遮阳率为70%时，盆景灵芝体内的SOD、CAT和POD活性均最高，可见，70%遮阳率时的光照强度对灵芝生长最有利，此时体内活性氧积累较少，酶活性最高；另外，不同光强处理下，虽然灵芝体内抗氧化酶活性在整个生长周期内的变化规律基本保持一致，但酶活变化最大的节点却出现在不同时期，这表明在灵芝子实体的生长过程中除光照强度对灵芝生长造成的影响之外，抗氧化酶活性可能还与子实体发育间存在某种内在的调控机制。