几种板栗品种对链格孢菌的室内抗性比较及防治药剂筛选

栗佳宁， 李爱霞， 霍佳欢， 冯丽娜 郭思柔， 王建华，温晓蕾， 孙伟明， 齐慧霞*

（1. 板栗产业技术教育部工程研究中心，河北 秦皇岛 066004；2. 河北科技师范学院农学与生物科技学院，河北省作物逆境生物学重点实验室（筹），河北 昌黎 066600；3. 河北省邢台市林业和草原有害生物防治检疫站河北 邢台 05400）

板栗（Castanea mollissimaBlume）为壳斗科栗属植物，是我国重要的经济林树种之一，也是我国食用最早的著名坚果之一，富含蛋白质、碳水化合物、脂肪、钙、磷、铁、锌、多种维生素等营养成分，具有延年益寿、健脾养胃、止血消肿等功效[1-2]。近年来，板栗种植产业高速发展，但板栗病害愈发严重，严重影响其产量及品质。据统计，每年因果仁腐烂造成的经济损失高达50%[3]。同时，由于气候环境的变化，原先较弱的病原菌逐渐转变为强优势致病菌，从而引发板栗新病害的发生和流行。2007年，北京林业大学在北京怀柔首次发现由CandidatusPhytoplasma castaneae引起的板栗黄化皱缩病[4]；2022年唐山、秦皇岛、承德等板栗主产区也受到该病原菌的侵袭[5]，造成大部分板栗绝产；2010年姜淑霞等[6]发现，Phomopsis mollissima引起板栗褐缘叶枯病，该病害严重时影响发芽抽梢，且极易诱发板栗疫病，引起树木整株死亡。

板栗果实腐烂病是栗仁常见的主要病害，严重影响板栗的口感。研究发现，该病害由多种真菌复合侵染所致[7]；欧洲板栗内腐病的病原菌包括6个属[8]，我国包括13个属[9-11]。链格孢菌（Alternaria alternata）是课题组前期在感病栗仁上分离获得的1株病原菌，通过验证证实其为冀东地区引起板栗内腐病的主要致病菌之一，与王海霞等[12]报道的北京地区优势菌株一致。该病原菌寄主范围广泛，可侵染柑橘[13]、番茄[14]、高粱[15]等400多种植物。近年来板栗内腐病在河北、山东等北方主要板栗产区呈暴发趋势[16]，该病害的主要特点是栗果外观无异常，而在栗仁上产生各种各样的坏死性斑点，严重影响板栗产量、品质，大大降低了当地农户的经济效益[17-20]。抗性品种的栽培及合理喷洒杀菌剂是防治板栗内腐病的重要措施。目前关于板栗内腐病研究主要集中在病害危害症状、主要致病菌及其生物学特性、侵染循环、发病规律、防治技术等方面[21-22]，2022年张娜娜等[23]、霍佳欢[24]分别针对层出镰孢（Fusarium proliferatum）、禾谷镰孢（F. graminearum）和可可毛色二孢（Lasiodiplodia theobromae）的抗性品种筛选方面开展了研究。关于板栗品种对A. alternata抗性筛选的相关研究尚未见报道。因此，本研究选取当地14个板栗品种，采用菌丝块离体接种法研究其对A. alternata的室内抗性，并进一步通过统计分析发病率、病斑直径对其抗性进行比较，为生产上筛选优质抗病品种。此外，为了生产上能高效地防治内腐病的发生，选取7种高效低毒化学杀菌剂进行室内药剂筛选，旨在为开展田间药效试验及病害防控奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株为板栗内腐病病原菌链格孢菌（Alternaria alternata），由河北省板栗产业协同创新中心提供。菌种于试管4 ℃保存，转接于PDA（potato dextrose agar）平板上活化。

供试培养基为PDA培养基：葡萄糖15～20 g、马铃薯200 g、琼脂粉15～20 g、纯净水1 000 mL。

供试板栗品种包括‘遵玉’‘紫珀’‘燕宝’‘燕紫’‘东陵明珠’‘老品种’‘燕秋’‘小薄皮’‘燕龙’‘燕丽’‘燕奎’‘燕山早丰’‘大板红’‘燕山短枝’共14个品种。

供试杀菌剂：25%嘧菌酯悬浮剂、25%咯菌腈悬浮剂、10%苯醚甲环唑水分散粒剂购自先正达作物保护有限公司；10%多抗霉素可湿性粉剂购自日本科研制药株式会社；20%吡噻菌胺悬浮剂购自日本三井化学AGRO株式会社；25%氰烯菌酯悬浮剂购自江苏省农药研究所股份有限公司；30%丙硫菌唑悬浮剂购自安徽久易农业股份有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 板栗果仁接种方法 使用打孔器（0.5 cm）在活化好的病原菌(A. alternata)菌落边缘打取菌饼备用；然后选取14个板栗品种新鲜、健康、无损伤的果仁，采用菌丝块针刺法[25]进行接种。先将果仁用75%酒精进行表面消毒30 s，再用无菌水冲洗3次；在果仁的顶部、底部、腹部分别用注射器造成1针的微伤口，将具有菌丝的一面接种于伤口处，以接种空白培养基为对照；用保鲜膜进行固定保湿，置于已浸湿无菌滤纸的培养皿中。每处理5个果仁，重复3次，25 ℃培养24 h后去除菌丝块，定时检查接种部位是否发病，并采用十字交叉法测量病斑扩展情况。

1.2.2 不同品种对A. alternata抗性评价方法 病斑发病率法：根据王冬梅等[26]对核桃炭疽病的抗性评价方法，定时检查接种部位发病情况，计算发病率，公式如下。

病斑平均直径（average lesion diameter，AD）法：根据A. alternata接种后第9天时的病斑直径大小进行等级划分，分析14个板栗品种对A. alternata的抗性。分级标准如下：1级，0 cm＜AD≤0.2 cm；2级，0.2 cm＜AD≤0.4 cm；3级，0.4 cm＜AD≤0.6 cm；4级，0.6 cm＜AD。

系统聚类分析法：根据张娜娜等[23]对栗果镰孢菌室内抗性评价方法，依据接种后第9天时病斑直径，运用平方欧氏距离法，以欧氏距离2作为最佳聚类分割点，分析14个板栗品种对A. alternata的抗性。

1.2.3 不同杀菌剂对病原菌的室内毒力测定 采用菌丝生长速率法[27]，测定不同杀菌剂对A. alternata的毒力，将嘧菌酯悬浮剂、咯菌腈悬浮剂、多抗霉素可湿性粉剂、吡噻菌胺悬浮剂、苯醚甲环唑水分散粒剂、氰烯菌酯悬浮剂和丙硫菌唑悬浮剂共7种杀菌剂采用推荐含量作为中间水平进行初步筛选，分别为660、500、660、500、330、560和18 mg·L-1。在超净工作台中配制含药PDA平板，用打孔器取其病原菌菌饼（0.7 cm）置于不同含药PDA中央，以不加杀菌剂的PDA培养基作为对照（CK），进行杀菌剂初步筛选，25 ℃培养5 d，每处理重复3次，采用十字交叉法测量菌落直径，计算抑菌率[28]，公式如下。

根据病原菌在含不同杀菌剂PDA培养基上菌丝的生长情况及抑菌率，选择抑菌率大于80%作为对该病害防控的有效杀菌剂。设置咯菌腈含量分别为15.63、31.25、62.50、125.00、250.00 mg·L-1；吡噻菌胺含量分别为62.5、125.0、250.0、500.0、1 000 mg·L-1。每处理重复3次，培养5 d后观察病原菌在PDA上的生长情况并测量菌落直径，以含量对数值x和抑制菌落生长百分率的概率值y求毒力回归方程，计算半最大效应浓度（concentration for 50% of maximal effect，EC50）。

1.3 数据分析

采用SPSS 23.0软件进行差异显著性检验和聚类分析。

2 结果与分析

2.1 不同板栗品种对A. alternata室内抗性鉴定

2.1.1 不同板栗品种接种A. alternata发病率分析 不同品种的发病率如表1所示。接种后第3天，‘遵玉’‘燕宝’‘燕奎’‘燕紫’‘燕秋’‘燕山早丰’和‘大板红’开始发病，其中‘燕宝’的发病率最高，为26.67%；其次为‘燕紫’‘燕秋’‘燕山早丰’‘大板红’，发病率为10.00%～18.00%；‘遵玉’‘燕奎’发病率较低，均低于5.00%。接种后第4天，所有品种均发病。随着接种时间的延长，‘遵玉’发病速率最快，到第9天时遵玉发病率达100.00%，说明该品种对A. alternata病原菌表现出明显的感病性。‘燕龙’‘大板红’‘燕山短枝’的发病率均低于55.00%，说明这3个品种对A. alternata具有一定的抗性。

9 d种接Inoculation 9 d 100.00±0.00 aA接种2.22 aA 97.78±8 d Inoculation 8 d t varieties 2.22 aA种7 d 95.55±病率lterna ria的6 d种lated in different C hinese chestnu发Disease incidence/%Inoculation 7 d种A. a2.22 aA Inoculation 6 d接88.89±率接接ria inocu 发病种品栗板同不种接2.22 aA 1表ce of A. alterna Table 1 Inciden 5 d Inoculation 5 d 71.11±4 d种接Inoculation 4 d 2.22 aAB 42.22±3 d种接Inoculation 3 d 4.45±2.22 dD品种Variety 玉Zunyu遵2.22 bB 82.22±2.22 bBC 75.55±2.22 cCD 62.22±2.22 dBC 48.89±D 2.22 cdeBC 48.89±0.00 bC 33.33±0.00 aA 26.67±宝Yanbao燕C 0.00 bcB 80.00±2.22 bB 77.78±2.22 bB 75.55±2.22 bB 57.78±2.22 eD 44.45±2.22 cD 24.45±0.00±0.00 dD种Laopinzhong品老D 2.22 bcdBC 77.78±D 2.22 cdC 68.69±0.00 cC 66.67±2.22 bB 57.78±2.22 bB 55.55±2.22 bBC 35.55±0.00±0.00 dD珀Zipo紫D 2.22 cdeBC 75.55±2.22 bBC 75.55±0.00 cC 66.67±2.22 bcB 55.55±2.22 bB 55.55±2.22 aA 44.45±4.45±2.22 dD奎Yankui燕D 2.22 cdeBC 75.55±D 0.00 cdC 66.67±0.00 cC 66.67±2.22 bB 57.78±C 0.00 bcB 53.33±2.22 cD 24.45±0.00±0.00 dD珠Donglingmingzhu明陵东D 0.00 deC 73.33±D 0.00 cdC 66.67±2.22 eEF 48.89±0.00 dC 46.67±0.00 fE 33.33±2.22 cD 24.45±2.22 bB 17.78±紫Yanzi燕D 0.00 deC 73.33±2.22 cCD 68.89±2.22 cCD 62.22±2.22 dBC 48.89±D 0.00 deC 46.67±F 2.22 deE 15.55±0.00±0.00 dD皮Xiaobopi薄小2.22 eD 71.11±2.22 eE 57.78±H 2.22 fgG 37.78±E 0.00 efD 33.33±0.00 gEF 26.67±F 2.22 deE 15.55±0.00 cBC 13.33±秋Yanqiu燕2.22 eD 71.11±2.22 eE 57.78±2.22 eEF 48.89±2.22 fDE 31.11±2.22 fgE 31.11±G 2.22 efF 11.11±2.22 cC 11.11±丰Yanshanzaofeng早山燕2.22 fE 62.22±0.00 gF 53.33±E 2.22 deD 62.22±2.22 fF 48.89±2.22 dDE 55.55±2.22 fFG 42.22±C 2.22 cdB 51.11±2.22 eD 37.78±D 2.22 bcdBC 51.11±2.22 fgE 31.11±2.22 aAB G 42.22±0.00 eEF 13.33±0.00±0.00 dD 0.00±0.00 dD Yanli丽燕燕龙Yanlong 2.22 gFG 51.11±2.22 fF 48.89±0.00 fGH 40.00±2.22 fDE 31.11±2.22 fgE 28.89±E 0.00 cdD 20.00±2.22 cC 11.11±红Dabanhong板大2.22 hG 44.45±2.22 gF 42.22±0.00 gH 33.33±2.22 fE 28.89±0.00 hF 20.00±6.67±0.00 fG 0.00±0.00 dD枝Yanshanduanzhi短山燕respectively.levels，0.05 0.01 and P＜。著显异差平0.05水P＜0.01和n indicate significant differences between different varieties at P＜P＜在e colum别ercase letters in sam 间种品同不示表分母字写、小大注Note：Differen t capital and low同不列同：

2.1.2 不同板栗品种对A. alternata的抗性分析对A. alternata在不同板栗品种上病斑扩展直径进行分析，结果（表2）表明，病原菌在14个供试品种的栗仁上均可侵染，但其病斑扩展范围存在差异，接种后第9天病斑扩展直径为0.13～0.90 cm。采用病斑平均直径法和系统聚类分析法均可将14个板栗品种划分为4个类群（图1），类群Ⅰ包括5个品种，占供试品种33.33%；类群Ⅱ包括6个品种，占供试品种40.00%；类群Ⅲ包括2个品种，占供试品种13.33%；类群Ⅳ仅包括1个品种。在供试板栗品种中未发现对A. alternata免疫的品种。各品种抗性表现为‘燕山短枝’＞‘大板红’＞‘燕丽’＞‘燕奎’＞‘老品种’＞‘燕龙’＞‘燕山早丰’＞‘小薄皮’＞‘燕秋’＞‘紫珀’＞‘燕宝’＞‘燕紫’＞‘东陵明珠’＞‘遵玉’。

图1 14个板栗品种接种A. alternata病斑直径聚类分析Fig. 1 Cluster analysis of 14 Chinese chestnut varieties based on AD of disease spots inoculated by A. alternata

表2 不同板栗品种对A. alternata的抗性Table 2 Resistances of different Chinese chestnut varieties to A. alternata

2.2 7种供试杀菌剂室内筛选

2.2.1 7种杀菌剂对A. alternata抑菌效果的室内筛选 不同水平的7种杀菌剂对A. alternata菌落生长均有一定的影响（表3，图2）。在25 ℃培养5 d，咯菌腈对A. alternata的抑制效果最佳，菌落直径为0.40 cm，抑制率高达93.75%；其次是吡噻菌胺，菌落直径为1.07 cm，抑制率为83.33%；嘧菌酯的抑菌效果最差，菌落直径为3.92 cm，抑制率仅38.80%。7种杀菌剂对A. alternata的抑菌效果表现为咯菌腈＞吡噻菌胺＞苯醚甲环唑＞丙硫菌唑＞氰烯菌酯＞多抗霉素＞嘧菌酯。

图2 不同杀菌剂下A. alternata的生长Fig. 2 Growth of A. alternata under different fungicides

表3 不同杀菌剂对A. alternata的抑制效果Table 3 Inhibitory effects of different fungicides on A.alternata

2.2.2 2种杀菌剂对A. alternata室内毒力测定为了明确咯菌腈和吡噻菌胺适宜的杀菌水平，采用不同水平的杀菌剂对A. alternata进行抑菌试验，结果（表4,图3）表明，CK菌落的直径为6.30 cm；经杀菌剂处理后菌丝生长缓慢。在含咯菌腈杀菌剂的平板上，菌落直径为0.55～5.78 cm，当咯菌腈为250.00 mg·L-1时，抑菌率达到90%以上，显著高于其他处理；其余处理的抑菌率均低于60%；毒力分析表明EC50为69.94 mg·L-1。在含吡噻菌杀菌剂的平板上，不同处理对A. alternata菌丝的抑制效果不同，当吡噻菌为500.0、1 000.0 mg·L-1时，菌落直径分别为1.82、1.45 cm，抑菌率均达70%以上，显著高于其他处理；毒力分析表明EC50为71.96 mg·L-1。

图3 不同水平供试杀菌剂下A. alternata菌丝的生长Fig.3 Mycelial growth of A. alternata under different levels of tested fungicides

表4 不同含量的杀菌剂下A. alternata菌丝的生长Table 4 Growth of A. alternata mycelia at different contents of tested fungicides

3 讨论

采用室内离体接种病原菌筛选抗性品种的方法已得到广泛应用。室内接种避免了田间自然接种及外界环境的影响，既能保证接种条件的一致性，又可以保证抗病性评价的稳定性及准确性。欧智涛等[29]对11个柑橘品种的离体叶片进行抗溃疡病菌鉴定，筛选出‘长安金柑’为高抗品种；贾晓辉等[30]根据聚类分析法和病斑平均直径法均将梨和苹果种质划分为5类；霍佳欢[24]首次在板栗上运用系统聚类分析法进行可可毛色二孢和茄镰孢（Fusarium solani）抗性品种的筛选，并筛选出抗病品种‘紫珀’‘燕山早丰’‘燕奎’‘燕紫’‘燕秋’；张娜娜等[23]同样运用系统聚类分析法测定了20个板栗品种对3种镰孢菌抗性。本研究首次根据发病率、病斑平均直径法和系统聚类分析法分析14个板栗品种对A. alternata的抗性，通过观察接种后的发病率和病斑直径扩展情况，未发现免疫品种，不同品种的发病率存在差异；接种后9 d，‘遵玉’发病率最高，为100%；‘燕山短枝’和‘大板红’发病率最低，分别为44.45%和51.11%；采用病斑平均直径法和系统聚类分析法均将14个板栗品种划分为4个类群；根据病斑直径各品种的抗性表现为‘燕山短枝’＞‘大板红’＞‘燕丽’＞‘燕奎’＞‘老品种’＞‘燕龙’＞‘燕山早丰’＞‘小薄皮’＞‘燕秋’＞‘紫珀’＞‘燕宝’＞‘燕紫’＞‘东陵明珠’＞‘遵玉’。通过3种方法评价14个品种的抗性，结果表明，‘遵玉’的抗性较弱；‘燕山短枝’和‘大板红’的抗性较强，与张娜娜等[23]研究结果一致。未来将分析更多板栗品种资源对A. alternata的抗性，为板栗抗病育种的亲本选择提供参考。

科学用药是防治植物病害的有效措施，在室内采用菌丝生长速率法测定杀菌剂对病原菌的毒力是筛选有效杀菌剂的主要方法，也是后期进行田间药剂防控的基础依据。试验采用菌丝生长速率法对A. alternata进行了7种杀菌剂室内筛选，发现咯菌腈对该病原菌抑制效果最好，抑菌率达到90%以上，EC50为69.94 mg·L-1，与前人研究结果一致[31]。本研究中嘧菌酯对板栗内腐病菌A. alternata抑菌效果最差，抑制率仅为38.80%，而嘧菌酯对A. alternata引起的甜瓜黑斑病的抑制效果最佳[32]，这可能是寄主不同导致A. alternata对杀菌剂敏感程度不同。此外，本试验仅对A. alternata进行了室内毒力测定，还需进一步研究田间药效；同时，长期使用杀菌剂防治会使病原菌的抗药性不断提高，因此在进行药剂防治时，应准确掌握施药时间、用量，并轮换使用药剂。